三孢酸的作用机制及其结构类似物的合成研究

三孢酸可大幅度促进三孢布拉氏霉菌合成类胡萝卜素，但其作用机制尚不清楚。本项目拟利用二维凝胶电泳结合MALDI-TOF-MS技术分析三孢酸存在及缺失条件下三孢布拉氏霉菌蛋白表达差异，以确定三孢酸作用的关键酶系，进一步通过实时定量PCR技术从基因水平揭示三孢酸作用的关键基因，阐明三孢酸促进类胡卜素合成的机制。以此为基础，根据三孢酸的特征结构，理性设计并合成廉价的三孢酸类似物，优化发酵过程中类似物添加策略，建立三孢酸类似物添加条件下的发酵动力学，以期为提高三孢布拉氏霉菌中类胡萝卜素发酵水平提供依据。这一研究结果对通过甲羟戊酸途径合成的异戊二烯类化合物的生产有重要的参考价值，并将丰富蛋白质组学及代谢工程的基本理论，因而具有重要的理论意义和实用价值。

三孢布拉氏霉菌是目前工业化发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素的唯一的毛霉目真菌。三孢酸可大幅度促进三孢布拉氏霉菌合成类胡萝卜素，但其作用机制尚不清楚。本研究首先通过代谢组和蛋白质组分析，研究了三孢布拉氏霉菌对三孢酸的响应机制，发现三孢酸在代谢水平上的作用效果主要反映在脂肪酸、碳水化合物、氨基酸以及类胡萝卜素含量的变化上，同时也发现三孢酸的调控除了涉及类胡萝卜素合成外，也涉及糖酵解、三羧酸循环支路、脂肪酸合成等代谢途径，表明三孢酸是全局性的调控因子。本研究还发现类胡萝卜素的合成和脂肪酸合成具有显著的相关性。因而添加亚油酸反馈抑制三孢布拉氏霉内源脂肪酸的合成，以及向三孢布拉氏霉菌培养基中添加香叶醇等类胡萝卜素合成的前体物，均使类胡萝卜素产量大幅提高40-60%。另外，发现一种植物激素—花生四烯酸对三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素的合成也具有与三孢酸相似的促进作用。.对三孢布拉霉中涉及萜烯类物质合成的八个基因的转录水平分析发现，四个β-胡萝卜素合成途径的基因（ipi、carG、carRA和carB）在三孢酸添加后转录水平增强。这一结果表明三孢酸通过刺激转录增强萜烯类物质在三孢布拉霉中的合成，同时也表明基因ipi和carG在类胡萝卜素合成中扮演重要角色。之后成功克隆并表达了三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成途径中的关键酶编码基因ipi和carG的cDNA，并通过基因ipi和carG在大肠杆菌中的表达发现这两个基因所编码的代谢酶对类胡萝卜素的合成具有协同作用。三孢布拉霉的GGPS和IPI的引入使得基因工程E. coli的β-胡萝卜素含量增加了89.2%。本研究为类胡萝卜素的遗传工程生产提供了新的基因来源。