合成生物学在生物转化生产1,4-丁二醇中的应用基础研究

1,4-丁二醇是一种重要的平台化合物，广泛用于生产工程塑料及纤维。与化学合成法相比，通过生物转化途径生产1,4-丁二醇具有明显的资源与环境优势。然而，天然微生物缺少合成1,4-丁二醇的代谢途径，当前的1,4-丁二醇生物合成的方法是通过生物转化葡萄糖为丁二酸，然后丁二酸再化学催化加氢转化成1,4-丁二醇。本项目基于合成生物学思路设计了全新的代谢途径，通过组合不同来源的酶基因，在大肠杆菌中构建转化木糖生产1,4-丁二醇合成酶基因表达体系，并深入分析外源基因转入后，细胞内各关键酶和代谢中间产物的变化，以此为参考来改造共同途径以及分支途径。建立代谢途径通量的动力学模型，结合模型优化与培养过程参数优化等手段，去除合成通路的瓶颈，最终达到对1,4-丁二醇生物合成的高效调节。本项目不仅对1,4-丁二醇生物合成有重要意义，而且为木质纤维半纤维素水解糖的高值化利用提供理论支持。

1,4-丁二醇是一种重要的平台化合物，通过生物转化途径生产1,4-丁二醇具有明显的资源与环境优势。然而，天然微生物缺少生成1,4-丁二醇的代谢途径。本项目在大肠杆菌中建立转化木糖生产1,4-丁二醇合成酶基因表达体系，并对其代谢机制进行了深入探讨。主要开展了以下三方面研究，并取得如下结果： .研究一： 1,2, 4-丁三醇关键酶基因的克隆及工程菌株的构建。成功构建含有苯甲酰甲酸脱羧酶基因和木糖脱氢酶基因的组表达载体pSLQMG，其在E.coliJM109（DE3）中表达效果较好。含有重组质粒pSLQMG的菌株SLQMG3木糖发酵试验，发酵24h时产醇达到最大值，1,2,4-丁三醇产量可达0.42g/L。通过Red同源重组法成功构建E.coli JM109（DE3）的基因xylAB缺失突变株。并将pSLQMG转化入上述构建的缺失突变株，获得阳性重组菌SLQMG4，发酵检验SLQMG4的1,2,4-丁三醇产量提高了38%。.研究二： 1, 4-丁二醇关键酶基因的克隆及工程菌株的构建。克隆克雷伯氏肺炎杆菌非特异性二醇脱水酶（pdd）基因和氧化还原酶（yqhD）基因，并构建表达质粒pET-pdd、pET-pdd-yqhD和pET-pdd-yqhD-lacZ，并分别转入前期构建的E.coli SLQMG4中，获得高效表达的重组菌株E.coli WL1、E.coli WL2和E.coli WL3。经过摇瓶发酵检测，以30g/L木糖为底物三个工程菌株的1,4-丁二醇（BDO）产量分别为0.29g/L、0.47 g/L和0.66 g/L。.研究三：1,4-丁二醇工程菌株代谢控制策略的优化。采用菌体生长模型、产物形成模型和基质消耗模型对工程菌株1,4-丁二醇有氧批式发酵过程加以描述，对模型参数求解及验证表明，该组模型描述1,4-丁二醇有氧批式发酵过程，对不同通气量、木糖浓度范围均表现出良好的适用性。进一步对不同溶氧条件下1,4-丁二醇的形成进行分析。结果发现，微氧条件进行发酵所得1,4-丁二醇浓度和得率均有明显优势，而强供氧条件更有利于菌体的增殖。因此，确定工程菌株产1,4-丁二醇的方案为前期较强供氧（0.3vvm），24小时后期微供氧（0.1vvm）的方案。据此策略，5 L发酵罐上1,4-丁二醇浓度可达0.69 g/l，明显高于同等条件下完全恒定通气发酵的结果。