双菌分担水飞蓟宾生物合成的动态代谢工程研究

Significant progress has been made for natural product production using metabolic engineering. However, some drawbacks, such as heavy metabolic burden, low biosynthetic efficiency and difficulty in metabolic regulation, hinder efficient production of natural products with complex and long pathway. In this project we intent to take the biosynthesis of silybin in E.coli as an example, solve the above-mentioned problem through co-culture and dynamic regulation, and achieve efficient synthesis of target compounds. Research contents include: screening for efficient enzymes to provide prerequisite for pathway construction; achieve the balance inside each module and between modules by multivariate modular optimization, preventing the accumulation of intermediates; to release metabolic burden, distribute the modules into different strains and establish E. coli co-culture system; to achieve coordinated growth of co-culture strains and product synthesis, construct dynamic response system on caffeic acid, controlling the growth of upstream strain and gene-expression in the downstream strain; optimize fermentation parameters and fed-batch strategy to further improve the titer. This project will provide new methods to balance and optimize complex biosynthetic pathway, and provide new strategy for sustainable production of valuable active ingredients of Chinese medicine.

利用代谢工程技术生产天然产物取得了重要进展。但对于途径复杂、多步骤的天然产物合成过程，则存在菌体代谢负担重、合成效率低、调控困难等问题。本项目拟以大肠杆菌合成水飞蓟宾为例，通过共培养及动态调控等策略解决上述共性问题，实现目标产物的高效合成。具体包括：通过筛选高效的外源酶为途径构建提供基础保证；通过多变量模块化优化实现模块内部及不同模块之间的平衡，避免中间代谢物的积累；为减少代谢负担，将优化后的模块合理分配到不同菌株中，建立大肠杆菌共培养系统；为实现共培养菌株的协调生长及水飞蓟宾的合成，建立并优化咖啡酸的动态响应系统，控制上游菌株的生长及下游途径的表达；优化发酵参数及流加策略进一步提高产量。本项目为复杂生物合成途径的平衡和优化提供新思路，为其他稀有中药活性成分的可持续生产提供新方法。

生物合成长途径复杂化学品存在菌体代谢负担重、合成效率低、调控困难等问题。微生物共培养在劳动分工减轻代谢负担，途径区室化提供合适酶催化环境等方面具有显著优势，但同时也存在菌群比例缺乏稳定性和调节能力等不足。本项目以大肠杆菌合成水飞蓟宾为例，设计了新型稳定自调控共培养体系，提高了产物合成效率，首次实现了一锅法生物合成水飞蓟素。首先，提出了基于多代谢物互利共生提高共培养体系稳定性的思路，通过分析细胞代谢网络，选择细胞能量代谢和氨基酸合成用于细胞间的交流载体，建立了超稳共培养体系。以红景天苷合成为例，该体系表现出优异的传代稳定性及放大稳定性，在发酵罐中产量达到12g/L，显示出工业应用潜力。接着，利用该体系合成水飞蓟宾前体松柏醇，发现了中间体大量积累的问题，表明菌群比例不协调，导致上下游途径转化能力不适配。为此，挖掘了响应咖啡酸的生物传感器，将咖啡酸动态响应系统引入合成体系，实现了菌群比例的自主调节，松柏醇产量提高了2倍。为了实现水飞蓟宾的生物合成，将整合途径分为咖啡酸合成、松柏醇合成、花旗松素合成及水飞蓟素合成模块，通过模块优化适配，并将双菌共培养拓展至三菌共培养，实现了水飞蓟宾的生物合成。将共培养策略用于香兰素的生物合成，发酵罐产量达到3.8 g/L，已与企业合作，正在进行中试放大。总之，本项目成功建立了稳定自调节的微生物共培养体系，为长途径复杂化学品的高效合成提供了技术平台。