在食管癌细胞株中过表达Lrig1调控PTEN的分子机制研究

Leucine-rich repeats and immunoglobulin like domains 1 (Lrig1) is a cell surface protein of being able to decrease the activity of EGFR,but in the cytoplasm of tumor cells,the molecular mechanism of Lrig1 as proto-oncogene regulates the expression of PTEN has not been reported. The project intends to overexpression of Lrig1 in esophageal cancer cell lines 109,KYSE450 and TE-1 using green fluorescent protein fusion construct or immunofluorescence to determine the localization of Lrig1 protein in the cell, using the methods of qRT-PCR,Western blot,and intracellular signal transduction pathway inhibitors to study the effects of Lrig1 on PTEN's expression and the possible signaltransduction pathway. Then detect the effects of Lrig1 on the cell cycle and apoptosis by flow cytometry. All together to evaluate the effects of high expression of Lrig1 as an oncogene on cell cycle, apoptosis, and provide the experimental basis on the molecular mechanism of the regulation of PTEN expression.

在星形胶质瘤等几种组织肿瘤细胞中，Lrig1作为抑癌基因通过在细胞膜上干扰EGFR的活性从而抑制肿瘤生长；但在肿瘤细胞浆中Lrig1作为原癌基因调控抑癌基因PTEN表达的分子机制尚未见报道。本项目拟在食管癌细胞株Eca109、KYSE450和TE-1中过表达Lrig1，应用绿色荧光蛋白融合表达法或免疫荧光技术确定Lrig1蛋白在细胞中的定位，采用qRT-PCR和Western blot方法及细胞内信号传导通路抑制剂明确Lrig1对PTEN表达的影响与可能参与调控的主要信号通路，应用流式细胞仪检测过表达Lrigl对细胞周期和细胞凋亡的影响，最终确定Lrig1作为原癌基因在肿瘤细胞的高表达对细胞周期、凋亡的影响，以及为探索其对PTEN表达调控的分子机制奠定实验基础。

研究发现Lrig1在不同的组织中表达水平差异巨大，在大多数肿瘤组织中，Lrig1表达缺失或减弱。当应用GFP-Lrig1融合基因表达载体在不同的细胞转染过表达后，过表达的LRIG在细胞中定位随细胞不同而变化。人们猜测定位于细胞膜和核周围，LRIG将发挥抑癌基因的作用；而定位于细胞浆内，LRIG将可能发挥原癌基因的功能。结果显示在ECA109细胞中过表达Lrig1后检测发现过表达Lrig1蛋白定位于细胞浆而不是细胞膜、引起细胞G2期数量增多，细胞凋亡减少。过表达Lrig1与抑癌基因PTEN的表达呈负相关关系，Lrig1可能通过MAPK-MEK信息系统调控PTEN的表达。通过细胞信号通路抑制剂PD98059，BIS和KN-62干预，在转录水平，过表达Lrig1后，与正常对照组相比细胞中Lrig1表达量显著增高（P＜0.01），Pten的表达量降低（P＜0.05），而Survivin的表达量无明显变化(P＞0.05）。药物PD98059，BIS和KN-62对Lrig1的表达有明显抑制作用（P＜0.01），药物PD98059使Pten表达升高（P＜0.05），BIS使Pten表达降低（P＜0.05），KN-62对Pten的表达无明显作用（P＞0.05）。这三种药物对Survivin表达无明显作用（P＞0.05）。在蛋白水平，与正常对照组相比，Lrig1过表达的细胞中Lrig1蛋白表达量显著增加（P＜0.01），药物PD98059和KN-62使Lrig1蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。BIS对其蛋白无影响（P＞0.05）。Lrig1过表达对PTEN，SURVIVIN蛋白表达无明显作用(P＞0.05)。药物PD98059,BIS和KN-62均对PTEN，SURVIVIN蛋白表达无明显作用(P＞0.05)。流式细胞仪检测发现药物PD98059使过表达Lrig1的细胞24小时细胞晚期凋亡增加（P＜0.05）。结果提示在Eca109细胞中，Lrig1的表达与PTEN成负相关，与SVV的表达不直接相关。