氧化应激诱导CRT/ERp57膜外聚集改变黑素细胞免疫原性的机制研究

白癜风是临床上较为常见、难治的皮肤病，严重影响患者的容貌、心理和社会活动。白癜风病因研究中关于黑素细胞破坏或凋亡的病理机制尚不明晰，越来越多证据提示氧化应激在寻常型白癜风发病中可能为首发因素，氧化应激导致黑素细胞坏死或凋亡，并激活一系列异常免疫应答。我们提出如下假设：氧化应激诱导CRT/ERp57 膜表面聚集(endo- → ecto-)，黑素细胞的表面分子性质改变，免疫原性增强，促进抗原提呈、抗体产生和T细胞免疫反应。本项目拟运用流式细胞术、实时定量PCR 、蛋白免疫印迹、RNAi、激光共聚焦显微镜、显性负突变体等研究技术和手段，证明氧化应激诱导CRT/ERp57膜转位，启动异常免疫应答推动疾病发展；并探讨参与CRT/ERp57膜转位的可能通路，及抑制该通路过度活化的应用前景，为白癜风的治疗新靶点提供理论基础。

钙网织蛋白(CRT)是一种普遍存在于各种生物体内质网中的蛋白，并且被发现可以在一些细胞的细胞膜表面表达。它在细胞内维持Ca2+稳定、蛋白质合成等方面发挥重要作用。关于CRT外翻的机制，尤其是在启动细胞凋亡、外翻早于磷脂酰丝氨酸(PS)方面，是一个重要的领域。然而，CRT外翻于人黑素细胞表面及其在白癜风患者外周血中的表达水平，还未有报道。本项目对人永生化黑素细胞系PIG1和白癜风患者永生化外周黑素细胞系PIG3V进行研究。将两类细胞分别暴露于不同浓度的H2O2，并刺激不同的时间。通过过表达及CRT siRNA转染入细胞后，检测凋亡的水平；运用RT-PCR和western blot 来检测总的CRT蛋白的表达水平；用流式细胞仪及免疫荧光来观察分析细胞表面蛋白的表达水平。功能学方面，收集了25例白癜风患者及正常人的全血，用ELISA法对CRT抗原水平进行了检测；将CRT分别与患者及正常人的PBMC共孵育后，ELISA法检测炎症因子IL-6及TNF-α。同时，对进展期和稳定期患者的CRT水平进行对比，将CRT与皮损面积做相关性分析。我们发现随着细胞凋亡水平的升高，两类细胞中表面的CRT都随着时间的延长而逐渐升高，即从胞浆转至胞膜。同时，过表达能够增强黑素细胞的凋亡，抑制CRT表达后结果与其相反；另外，检测了白癜风患者和正常对照的血浆后发现，血浆中CRT抗原的水平是白癜风患者高于正常人(p<0.05)；同时，与CRT抗原共孵育组的IL-6及TNF-α均高于未加CRT组(p<0.05)；进展期患者血浆中的CRT水平高于稳定期，同时CRT与患者外周皮损面积呈正相关。以上结果证实了H2O2诱导的氧化应激条件下，黑素细胞中的CRT可以翻转至细胞膜表面，从而可能发挥着“eat me”信号作用，诱导黑素细胞发生免疫原性凋亡，引起后续的免疫应答反应,从而进一步对机体的黑素细胞产生攻击。因此，研究CRT在氧化应激中的作用，即CRT的外翻诱导黑素细胞发生免疫原性的凋亡，而阻断CRT的外翻可能为白癜风的发病机理及治疗方向提供了新的思路。