金黄色葡萄球菌ClfA蛋白粘附的分子机制及其B细胞表位的筛选鉴定

金黄色葡萄球菌感染与局部化脓感染的发生密切相关，耐药菌株不断出现，特别是耐甲氧西林菌株的迅速蔓延，导致无法单纯依靠抗生素治疗该菌引发的相关疾病，因此寄希望于免疫学手段来预防和治疗该菌感染。ClfA是金黄色葡萄球菌粘附于宿主细胞的最主要粘附因子之一，研究其粘附分子机制，对该菌的诊断及防治具有重要意义。本课题以临床分离的金黄色葡萄球菌为研究对象，通过建立检测ClfA的PCR方法，检测ClfA在临床分离株中的分布，为该菌的分子流行病学及病原学提供有效的研究手段；通过纯化ClfA蛋白制备单克隆抗体，研究ClfA蛋白单抗的粘附阻断作用，阐明金黄色葡萄球菌ClfA蛋白参与粘附的分子机制；鉴于该致病菌至今尚无有效疫苗，本研究拟采用随机噬菌体展示技术，筛选ClfA蛋白的B细胞表位，并对各表位进行分析比对，了解ClfA蛋白B细胞表位的特异性保护作用，为设计开发出高效安全的表位疫苗及基因工程疫苗提供重要依据。

本课题深入研究了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S.aureus）表面粘附蛋白ClfA与宿主细胞粘附的分子机制，并通过噬菌体展示及生物信息学等多种生物学手段，对ClfA的B细胞表位进行了筛选鉴定。主要取得如下学术成绩：1.对ClfA蛋白是否为保护性抗原进行了鉴定，采用原核表达得到纯化的粘附素ClfA蛋白，通过激光共聚焦显微镜观察粘附定位，进而通过粘附抑制与粘附动力学试验证明粘附素ClfA蛋白的粘附阻断作用，最后通过免疫保护实验，最终证实了菌毛粘附素ClfA蛋白可以作为S.aureus的保护性抗原。2.率先筛选鉴定了ClfA蛋白的B细胞表位，用纯化的抗ClfA蛋白的单克隆抗体作为筛选配基,对噬菌体展示随机12肽文库进行三轮生物亲和淘选，通过夹心ELISA、竞争ELISA鉴定出了41个阳性噬菌体克隆, 从中挑选16个阳性克隆进行序列测定和分析。发现阳性克隆大多呈递SKVGIDKRRGTA序列，其第5、6、7和11位置上的I、D、K、T氨基酸与ClfA氨基酸残基（383-394位）有较高同源。说明I、D、K、T可能决定了此B细胞表位的抗原性质，是该B细胞表位构成的关键氨基酸。使用带有SKVGIDKRRGTA序列的噬菌体克隆免疫小鼠, 通过ELISA和Western-blotting分析结果证实具有刺激小鼠产生抗体的能力，从而证明了C383-394是ClfA蛋白的B细胞表位。3.首次对ClfA蛋白的Th细胞表位进行筛选鉴定，采用生物信息学方法预测H-2d限制性Th表位，并合成表位肽, 采用淋巴细胞增殖试验、流式细胞分析等实验方法进行了筛选和鉴定，获得四个Th细胞表位（C214, C286, C335和C436），ELISA检测细胞因子试验，发现C214, C286和C436为Th2细胞表位，C335为Th1细胞表位。用已初步鉴定的表位多肽免疫BALB/c小鼠，进行淋巴细胞增殖试验来检测多肽免疫小鼠的细胞免疫应答，通过半定量RT-PCR检测多肽免疫小鼠脾淋巴细胞的细胞因子表达，发现表位肽能诱导机体产生特异性的CD4+ T淋巴细胞应答。通过该项目的资助，项目负责人经过3年的工作，发表SCI论文5篇（第一责任作者4篇，第二责任作者1篇），Medline收录论文1篇（第一责任作者），部分研究工作获得2014年度吉林省自然科学学术成果三等奖。