人X-SCID诱导多能干细胞定向T细胞分化模型的建立及疾病发生机制、治疗的研究

X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) caused by mutations of the gene for IL2RG has the highest rate of combined immunodeficiency diseases. X-SCID is fatal, and patients are characterized by the absence of or markedly diminished T cells. So far, there are no reports understanding X-SCID mechanisms on developmental cell biology and molecular network levels. In this project, we will reprogram somatic cells from X-SCID patients into induced pluripotent stem cells (iPS cells) to set up X-SCID model. By co-culturing with OP9-DL1 for T cell differentiation, we can figure out the T cell developmental kinetics of X-SCID iPS cells in vitro to identify the disease mechanism on developmental cell biology level. Based on understanding mechanism on developmental cell biology level, we will collect X-SCID and wild type samples from different stages of T cell differentiation for microarray analysis. Then we will compare and analyze transcripts between mutation and wild type samples by bioinformatics methodology to find genes and signaling pathways involved in X-SCID pathogenesis. This study can deep our understanding about X-SCID mechanism on molecular network level and provide potential targets for drug screening. Finally, we will correct IL2RG mutation in X-SCID iPS cells using genome editing technique, and differentiate the corrected iPS cells into hematopoietic stem cells to be transferred into SCID mice for human immune reconstitution. The methods and experience obtained in this study will provide references for human SCID treatment using iPS cells.

IL-2RG基因突变导致的X-SCID是致死性的、发病率最高的联合免疫缺陷病，表现为T淋巴细胞严重缺乏。目前虽然从遗传角度对其发病机制有一定认识，但仍缺乏从发育细胞生物学及分子网络的角度去探讨该疾病发生的深层次机制。申请人拟建立X-SCID患儿来源的诱导多能干细胞疾病模型，造血分化后与OP9-DL1共培养建立疾病模型iPS细胞的体外T细胞发育动力学模式，从而明确疾病发生的发育细胞生物学机制。在此基础上，运用生物信息学的分析方法比较不同T细胞分化阶段突变和野生型样本转录组数据，找出参与X-SCID的各种基因或信号通路，在分子网络水平进一步理解IL-2RG突变引起SCID的发病机理，为药物筛查提供潜在靶点。最后，利用基因组编辑技术在 iPS细胞中修复IL-2RG突变，定向分化为造血干细胞，将其注入免疫缺陷小鼠体内进行人免疫细胞重建，为iPS细胞应用于人SCID细胞移植治疗提供参考。

SCID是最严重的原发性免疫缺陷病，主要是由于T淋巴细胞发育相关基因突变导致，对人类健康造成极大危害。由于缺乏理想的研究模型，SCID发生发展的发育细胞生物学及分子机制仍然不清楚。本课题利用CRISPR-Cas9的方法构建SCID人诱导多能干细胞（iPS）模型。通过在iPS细胞中敲除IL2-RG和RAG2，我们建立了IL2-RG-/-和RAG2-/- iPS细胞模型。IL2-RG和RAG2的敲除对iPS的干性及多能性没有明显影响。随后我们通过拟胚体获得造血前体细胞，与OP9-DL4共培养进行T细胞分化。我们首次通过iPS定向T细胞分化模拟了IL-2RG-/- 和RAG2-/- SCID T淋巴细胞发育的动力学模式。我们的结果显示IL-2RG-/- iPS细胞体外T细胞分化从发育的起始阶段被明显阻断，不能分化得到CD7，CD5的T细胞前体。RAG2-/- iPS细胞展现了与IL2-RG-/-完全不同的发育分化模式。RAG2-/- iPS细胞在发育早期无明显异常，可以产生CD4+CD8+双阳细胞。我们还发现人RAG2-/-可以产生细胞质内CD3，但是不能产生外翻到细胞膜的成熟CD3，也不能产生TCRαβ，提示RAG2-/- iPS 的T细胞发育阻滞发生在分化晚期。。我们还发现RAG2敲除导致分化出的T细胞在分化后期出现明显细胞增殖下降，而野生型T细胞展现出良好的增殖能力。我们课题组首次建立了IL-2RG-/- 和RAG2-/- SCID T淋巴细胞发育的动力学分析，为探索人类SCID疾病发生机制提供借鉴。在iPS中过表达IL2-RG，大幅提高了iPS向T细胞的分化效率。目前通用的干细胞定向T细胞分化体系无法获得CD8单阳细胞，而过表达IL2-RG可以获得CD8单阳细胞。这个结果对于通过iPS细胞分化获得功能T细胞应用于肿瘤免疫治疗提供了新的方法。最后我们探索了使用CRISPR-Cas9的技术在IL2-RG-/- iPS里引入野生的IL2-RG基因，我们的结果显示外源IL2-RG的引入完全rescue了SCID iPS细胞的体外T细胞分化发育缺陷。我们的研究为利用CRISPR-Cas9结合iPS技术治疗SCID提供了方法学借鉴。