红斑丹毒丝菌表面抗原蛋白B细胞表位的高效筛选及鉴定

Epitope is the smallest unit for activating immune response, it is also the important target for the study of the adaptive immunity. Although lots of studies have been used for epitope screening, those methods are still time and cost consuming and not available for researching complex antigen B cell epitopes. We have used a new phage display-subcellular localization method to screen broad spectrum polyclonal antibodies of Erysipelothrix rhusiopathiae, and found that not only is the epitopes screening efficiency of our method far more than peptide microarray technology, but also can be used to identify the immunodominant B cell epitopes. In this study, we try to use 12-peptide and loop 7-peptide library to screen polyclonal antibodies of Erysipelothrix rhusiopathiae, respectively, and each 2500 samples will be randomly selected for homology search and subcellular localization analysis. Several hundred to thousands of mimotopes of bacteria will be obtained, and then the immunodominant epitopes are identified by using the methods with synthetic peptide (linear epitopes), site-directed mutagenesis (conformation epitopes) of recombinant proteins, and try to establish a new, fast and efficient screening method of complex antigen B cell epitopes. Therefore, the approach represents a valuable tool to study B cell epitopes and to identify new bacterial surface proteins which can provide valuable information for the study of bacterial pathogenesis or prevention.

表位是诱导免疫应答的最小结构单位，也是特异性免疫研究的重要对象。但复杂抗原B细胞表位的筛选至今仍没有很好的方法。我们前期的研究初步发现可以建立一种以多克隆抗体从噬菌体文库中高效筛选B细胞表位的方法，远远超过了肽芯片技术对复杂抗原表位的筛选效率。为明确该方法的优势，拟从12肽和环7肽噬菌体文库中各筛选2500个红斑丹毒丝菌表面蛋白的模拟表位，经信息生物学、统计分析和血清学验证等获得假定的优势B细胞表位。然后以合成表位多肽和定点突变靶标蛋白的重组蛋白为抗原，经动物免疫试验和血清学检测对优势B细胞表位进行多方面的鉴定，以建立高效筛选复杂抗原B细胞表位的方法。优势B细胞表位和相应的抗原蛋白无疑会为该病的诊断和新型疫苗的研制提供有价值的参考资料，也会为有关红斑丹毒丝菌表面蛋白结构与功能、该菌所致疫病发病机理和细菌与宿主的相互作用等方面的研究提供有价值的参考资料和基础数据信息。

表位是诱导免疫应答的最小结构单位，是免疫学研究的一个核心问题，还有大量的问题需要研究。本研究通过噬菌体表面呈现技术获得红斑丹毒丝菌（E.rhu）表面蛋白的多克隆抗体的拟表位，对E.rhu的表面抗原蛋白的B细胞表位及相应的抗原蛋白进行了系统的鉴定研究。建立了一种快速筛选复杂抗原表面抗原表位的方法，获得了E.rhu大量的表位信息及相应的表面蛋白信息，为该菌表面蛋白的结构与功能、该菌的致病机理以及诊断与新型疫苗的研究均可提供参考。.①、噬菌体展现技术的优化: 将抗体-噬菌体固相结合改成在溶液中的自由结合，将筛选的噬菌体文库分成小份在96孔板中进行扩增，降低了噬菌体文库多样性的丢失，提高了拟表位信息的准确性和丰富性；按传统的方法在初筛的噬菌体仅有 16%（36/224）的有效表位序列，而用改进方法则可达到72%，说明改进方法显著提高了筛选的准确性和效率。这对同类工作具有很好的借鉴作用。.②、大量拟表位的筛选及批量信息生物学分析：建立了E.rhu全部可能的表面蛋白的本地Blast数据库，批量对获得的拟表位肽进行分析，显著加速了分析工作。以此方法将分析以挑斑-测序方式获得2401个有效环7肽模似表位，发现其中2193个似表位能找到对应的表面蛋白，而1695个有效12肽模似表位，则有713个似表位能找到对应的表面蛋白。.③、9种E.rhu新的保护性抗原的发现：从获得的优势抗原表位入手，确定了18个细菌表面蛋白。通过动物免疫保护试验等研究证明其中9个为免疫保护性抗原蛋白。这一结果比免疫蛋白质组学和反向疫苗学的筛选效率要高得多，证明本研究方法在新抗原的筛选研究方面有着极大的优势。同时，新蛋白的发现也为细菌功能蛋白的研究提供了新的切入点。.以上研究发表ICR 一区Sci论文1篇，Frontiers in Microbiology. 2017 26;8:82..另外为提高大量表位肽的验证工作本研究还尝试将高效细菌碱性磷酸酶应用于这一工作，从4种环境微生物中克隆到了高效的碱性磷酸酶基因， 这为国内首次进行此类工作，该研究还在进行中。