猪场环境菌中氟苯尼考耐药基因的分布、流行及其与氟苯尼考残留的关联性

With the support of NSFC for Youth Scientists, our current work mainly focused on the molecular mechanism of transmission of cfr gene conferring resistance to five classes of antimicrobials including phenicols (florfenicol, FFC) in animal-borne bacteria, and made a significant progress. We found that most of the cfr carrying bacteria were isolated from pigs in intensive swine farms, and the isolation rates of cfr-positive bacteria has been arising. Moreover, we observed certain amount of FFC resistant bacteria which harbored uncharacterized FFC resistant determinants, and some of the novel FFC resistance gene has been identified. The long-term usage of FFC among food producing animal farms might contribute to the emergency and prevalence of FFC resistance genes (including the known and novel ones) in collected FFC resistant bacteria. At this stage, however, our study could not either provide the full picture of distribution and prevalence of FFC resistance gene in bacteria in environments of animal farms or understand the association between the environmental FFC residue caused by farm usage and the prevalence of FFC resistance genes in farm environmental bacteria. Based on the achievement of our previous study, we are planning to investigate the diversity, distribution, and prevalence of FFC resistant genes in environmental bacteria in swine farms mainly using the functional metagenomic tool as the main methods, and then explore the effects of environmental residue of FFC originated from swine farm usage on emergence and dissemination of florfenicol resistance genes. This project will provide theoretical risk assessment of antimicrobial resistance caused by the use of veterinary antimicrobials in livestock breeding.

在青年基金支持下，课题组开展了介导酰胺醇类（氟苯尼考，FFC）等五类药物耐药cfr基因在动物源细菌的传播机制研究并取得了重要进展。研究中发现cfr携带菌主要来源于集约化猪场，且检出率不断攀升，另外还存在一定比例机制未明的FFC耐药菌（从中已发现了一些新型FFC耐药基因）。养殖业长期使用FFC可能是导致FFC耐药基因（包括已知和未知基因）出现并促使其流行的主要原因。当前研究尚不能揭示养殖环境细菌群中FFC耐药基因的分布与流行全貌，也不确定养殖业使用FFC造成环境药物残留并引起FFC耐药基因流行的关联性。在已有研究基础上，本项目拟以集约化猪场为示例，以功能宏基因组学技术为主要手段，研究猪场环境细菌群中FFC耐药基因的多样性、分布规律与流行特征，同时探寻养猪场使用FFC造成环境药物残留对FFC耐药基因出现和流行的影响，为养殖业使用兽用抗菌药物引起耐药性的风险评估提供理论依据。

氟苯尼考（Florfenicol, FFC）是一种全世界都广泛使用的动物专用酰胺醇类抗菌药物，也是我国防治畜禽消化道和呼吸道细菌性感染疾病使用量最大的抗菌药物之一。因FFC易于人医临床治疗MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）、VRE（耐万古霉素肠球菌）等多重耐药G+菌感染的特效药物恶唑烷酮类产生交叉耐药性，使得近年来FFC耐药性问题越来越受到人们关注。目前，有关养殖场使用FFC是否会造成其环境土壤中氟苯尼考耐药基因（Florfenicol Resistance Genes, FRGs）的污染、是否产生新的耐药基因还不得而知。本研究重点围绕这些科学的问题开展研究，以期为探明养殖业上使用FFC与FRGs的关联性。.本研究通过非细菌培养方法直接提取6个不同养猪场环境样品中细菌总DNA，利用荧光定量PCR对样品中的FRGs（fexA、fexB、cfr、optrA、floR和pexA）和转座酶进行检测，采用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台进一步分析FRGs与转座酶基因的相关性。结果发现不同养猪场土壤FRGS存在着不同程度的污染，长期大量使用的猪场明显比使用量较少的猪场污染严重；样品中FRGs与转座酶基因的含量呈显著正相关性（r2=0.9833，p<0.0001）。同时，宏基因组测序分析显示猪场土壤中还存在包括氨基糖苷类、四环素类、大环內酯类等多种其他抗菌药物耐药基因的污染。此外，细菌多样性分析显示FRGs可能通过相关转座酶基因在土壤细菌中传播。.在氟苯尼考耐药性产生机制研究上，首先在猪源嗜麦芽窄食单胞菌中发现了氟苯尼考外排泵floR变异体floRv，并揭示其分子流行特点；率先在肠球菌中发现了一种由转运蛋白介导的酰胺醇类/恶唑烷酮类耐药的新基因optrA，并揭示其在人医临床和动物源肠球菌和葡萄球菌中的分子流行规律；首次在弯曲菌中发现了介导酰胺醇类、氟喹诺酮类等抗菌药物耐药的多重耐药外排泵CmeABC变异体RE-CmeABC，并阐明其作用机制及其分子流行特征；阐明了多重耐药基因cfr在大肠杆菌中的分子传播特征。.总之，亟需规范养殖业上对氟苯尼考的使用，并对FRGs的流行与传播进行监测和控制。同时，有关主管部门还有必要重新启动氟苯尼考在养殖业上的使用对人与动物的公共卫生安全再评价工作。