三疣梭子蟹P-gp转运蛋白在氟苯尼考代谢中功能的研究

P-glycoprotein transporter plays the key role in the metabolism of exogenous compounds, studies have shown that P-gp transporters play an important role in fish drug metabolism. But in crustaceans P-gp transporter functions are not clear. We choose florfenicol which was widely used in Portunus trituberculatus culture, studying the role of P-gp transporter in eliminating florfenicol; based on acquired P-gp transporter gene fragment, cloning this gene, sequence analysis, and expression characteristics of P-gp transporters in P. trituberculatus transport during antibiotic from mRNA level；by yeast two hybrid screening, identification P-gp transporters in the cell binding protein, preliminary analyze P-gp transporter transcriptional regulation mechanism. The results will be useful for revealing the molecular mechanism of florfenicol accumulation and metabolism in crustaceans, which will provide theoretical basis and technical support for healthy aquaculture and aquatic food safety.

P-gp转运蛋白（P-glycoprotein transporter）在外源化合物代谢中起关键作用，已有研究表明P-gp转运蛋白在鱼类药物代谢中发挥重要作用。但在甲壳动物中P-gp转运蛋白的功能尚不明确。本项目选择三疣梭子蟹养殖过程中广泛应用的抗生素-氟苯尼考，研究P-gp转运蛋白在氟苯尼考消除过程中的作用；在已获得的三疣梭子蟹P-gp转运蛋白基因序列片段的基础上，克隆此基因的全长序列，并从mRNA水平分析P-gp转运蛋白在三疣梭子蟹转运抗生素过程中的表达特征; 通过酵母双杂交技术筛选鉴定P-gp转运蛋白的细胞内结合蛋白，初步解析三疣梭子蟹P-gp转运蛋白对氟苯尼考的转录调控机制。这可为揭示氟苯尼考在甲壳动物体内累积与代谢的分子机制提供理论依据和技术支撑，对健康养殖以及水产食品安全都具有重要的意义。

渔用抗生素在水产动物体内的代谢一直是国内外研究的热点。基于前期比较转录组学工作基础，我们筛选到一个可能在三疣梭子蟹药物代谢中发挥重要功能的ABCB1基因序列片段。通过RACE技术克隆获得三疣梭子蟹ABCB1（即P-gp转运蛋白）基因的全长cDNA序列，命名为ptABCB1（GenBank登录号：KY487995）。该基因全长4923 bp，包括3519 bp的开放阅读框（ORF），659 bp的5’非编码区（5’UTR）和745 bp的3’非编码区（3’UTR）。通过注射ABCB转运蛋白特异性抑制剂——MK571，比较有无抑制剂对三疣梭子蟹组织中氟苯尼考累积及消除的变化。结果表明，在40 mg/kg氟苯尼考剂量下，药物在体内的累积阶段，注射抑制剂组的氟苯尼考在肝胰腺、肌肉、鳃和血淋巴中的累积量均高于无抑制剂组，达峰时间晚。药物消除阶段，抑制剂组消除速度比无抑制剂组缓慢一些。采用RT-PCR法，从mRNA水平分析氟苯尼考（FLR）对三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、鳃中ptABCB1表达的影响。结果显示，40 mg/kg剂量下，3 h前MK571+FLR组各组织中ptABCB1的相对表达水平受到抑制，显著低于FLR组（p<0.05），随着抑制剂作用的减弱表达水平迅速提高，肝胰腺、肌肉、鳃中的表达量分别于12、6、12 h达到峰值，且高于FLR组，最终两组的表达都趋于对照水平。构建了三疣梭子蟹酵母双杂交三框读码cDNA文库，该文库各质量参数均达标，且插入片段大小分布广泛，多样性良好，可用于利用酵母双杂交技术筛选关键基因的互作蛋白。为解析三疣梭子蟹0相代谢P-gp转运蛋白的功能，运用In-Fusion Cloning技术和Yeastmaker Yeast Transformation技术，构建了pGBKT7- ptABCB1诱饵载体。并利用酵母双杂交技术在三疣梭子蟹酵母双杂交三框读码cDNA文库中初步筛选出P-gp转运蛋白的互作蛋白。经过高度缺陷培养基的筛选、三框读码、回复杂交、测序及生物信息学分析，获得包括核因子kappa B亚基1（Nuclear factor kappa B subunit 1，NF-κB1）等7个三疣梭子蟹p-gp转运蛋白的互作蛋白。