利用报告基因系统对环状RNA发生和调控的分子机制研究

With the application of the next generation sequencing, a number of non-coding RNAs have been identified, including circular RNAs. However, the mechanisms of how circular RNAs are generated and their regulatory rules still remain largely unknown. Previously we constructed a single exon mini-gene reporter containing split GFP, and found that the pre-mRNA indeed produces circular RNAs through efficient back-splicing in human and Drosophila. Importantly, the resulting circular RNAs can be translated to generate functional proteins. Here we propose to systematically identify the cis-elements that regulate the biogenesis of circular RNA using GFP mini-gene reporter and next generation sequencing approaches. Subsequently, we will identify protein factors that bind to these cis-elements with affinity purification and mass spectrometry approaches, and further validate the functions of the identified splicing factors. Moreover, we will combine dual-color circular RNA reporter with BD pathway system to identify small chemicals that can regulate circular RNA biogenesis and functions. This project will partially uncover the regulatory mechanisms of circular RNA biogenesis, and provide experimental evidence to study the regulatory roles of small chemicals on circular RNA biogenesis. More importantly, this study provides great therapeutic potentials for targeting circular RNA related diseases in the future.

随着高通量测序技术的不断完善，越来越多的非编码RNA被鉴定出来，其中环状RNA也成为一个研究重点，但有关环状RNA的调控机制尚不清楚。我们前期研究利用报告基因系统证实了环状RNA可以通过反向剪接产生，并能够翻译成功能性蛋白（RNA，2015）。本研究将在前期工作基础上，首先采用本实验室经典的GFP报告基因系统与高通量测序技术相结合的方法，系统性研究调控环状RNA生成的顺式作用元件并验证其功能。其次，利用亲和层析与蛋白质谱技术相结合的方法，鉴定与环状RNA顺式作用元件相结合的蛋白剪接因子，并验证其功能及功能结构域。在此基础上，我们将利用环状RNA双色报告基因系统及高内涵细胞分析仪，鉴定调控环状RNA生成的小分子化合物，并对其功能和调控机制进行研究。本项目的顺利实施将进一步完善调控环状RNA生成的分子机制，并为今后利用小分子化合物调控内源性环状RNA的生成及功能提供可能性和更完善的实验依据。

随着高通量测序技术的完善，越来越多的非编码RNA被鉴定出来，其中环状RNA成为一个研究重点，但有关环状RNA的调控机制尚不清楚。本研究提出研究并完善环状RNA调控的分子网络，以期实现调控环状RNA生成的目的。.首先，我们构建了环状RNA报告基因，并利用其进一步研究环状RNA的调控机制。我们的结果显示，调控传统线性RNA可变剪接的顺式作用元件也能够影响环状RNA的生成，但是其调控机制却不完全相同。此外，我们同时还研究了内部核糖体进入位点（IRES）对环状RNA翻译的调控。我们在之前的环状RNA报告基因中分别插入不同长度序列的内部核糖体进入位点（IRES），来进一步研究不同IRES序列对环状RNA翻译的影响，我们的结果显示不同的人类内源性IRES都能够促进环状RNA的翻译。在此基础上，我们还研究了m6A修饰对环状RNA翻译的影响，我们发现在环状RNA中包含有一个或者两个m6A结构域的则能够有效地翻译成功能性蛋白，然而当m6A结构域发生突变以后则在很大程度上减少了功能性蛋白的生成。我们进一步的实验结果还发现m6A抗体可以特异性拉下来包含有m6A位点的环状RNA。我们接下来的工作研究了利用人工合成环状RNA调控因子（ECRR）的方法来促进环状RNA的生成。我们将PUF RNA识别模体符和能够形成二聚体的结构域相融合构建成ECRR，并将其应用在外源性报告基因和内源基因的环状RNA生成地调控，结果显示我们能够利用ECRR促进目的环状RNA的生成。.此外，我们还研究了传统RNA可变剪接的调控及其在肿瘤发生发展中的分子作用机制。我们探讨了调控传统RNA可变剪接的蛋白剪接因子RBM4在Hippo-YAP信号通路中的功能和分子作用机制。与此同时，我们还发现在肿瘤放疗和化疗过程中发挥重要功能的RNA可变剪接事件和蛋白剪接因子，并进一步探讨了其功能和作用机制。.通过本项目的资助与研究，我们已经在《Nature Communications》、《Cell Research》、《Cell Death & Diseases》、《EBioMedicine》等杂志发表4篇SCI论文，其中两篇影响因子大于10；两篇影响因子大于5，期间获得辽宁省科技进步二等奖和自然科学三等奖等。培养博士研究生3名，硕士研究生5名。