小麦盐胁迫响应基因TaHSP70的功能鉴定和调控机理解析

Salt stress is one of the major factors limiting wheat yield and quality. Our previous study has identified a salt responsive heat shock protein TaHSP70 in wheat, which was expressed mainly in endosperm and was induced by salt. The mutant has been obtained through CRISPR. In this project, we will analyze the potential function of TaHSP70 in salt tolerance and identify its upstream regulatory network using its CRISPR and overexpression transgenic wheat via genomics, bioinformatics, genetics and molecular biology methods. Specifically, to understand how TaHSP70 modulates wheat salt tolerance, we compared the transcriptomes of wild-type and the transgenic plants grown under salt stress conditions. By comparing the RNA-Seq results, the salt-responsive pathway will be identified. To further investigate which transcription factor regulates TaHSP70, we will perform the yeast one-hybrid system. Furthermore, the association between the genetic variations of TaHSP70 gene and salt tolerance will be evaluated using a diverse population of wheat consisting of 256 varieties from different regions. We hope to provide evidences for the molecular mechanism of salt tolerance in wheat. If the project is financially supported, we will publish 1-2 SCI paper, apply 1-2 patents and train 1-2 master's degree graduate students.

盐胁迫严重影响我国小麦产量和品质，鉴定小麦耐盐基因并解析其耐盐机理有利于提高小麦耐盐性。本实验室前期克隆到1个小麦盐胁迫响应的热激蛋白基因TaHSP70，其主要在小麦胚乳中表达；利用CRISPR-CAS9技术获得了TaHSP70基因的小麦功能缺失突变体。在此基础上，本申请课题拟以小麦TaHSP70的超表达和功能缺失转基因小麦及其受体为材料，综合采用功能基因组学、生物信息学、遗传学和分子生物学等研究方法，分析该基因在响应盐胁迫过程中的生物学功能，解析其上游和下游的调控途径，为研究小麦耐盐性的分子机制奠定基础。另外，对256份不同来源的小麦微核心种质进行耐盐表型性状分析，将TaHSP70序列变异和表达差异进行关联分析，筛选出最优等位基因，建立连锁的功能分子标记，为小麦抗盐育种提供种质。发表SCI文章2-3篇，申请专利1-2项，培养研究生2-3名。

小麦（Triticum aestivum L.）作为我国第二大口粮作物，土壤盐渍化程度的日益加剧，严重限制了小麦产量和品质的提高，因此发掘小麦耐盐基因、培育耐盐品种对于保障国家粮食安全具有重要的意义。我们前期通过转录组测序鉴定到一个盐胁迫响应的小麦热激蛋白/分子伴侣，经过同源比对将其命名为 TaHSP70。实时定量结果表明TaHSP70 ABD 3 个部分同源基因在盐胁迫后 1 h表达量最高；TaHSP70 Crispr 阳性转基因株系耐盐表型鉴定结果发现，盐胁迫处理后，Crispr 转基因株系株高、叶长、叶宽、粒长、粒宽均小于对照品种CB037，且SOD 及POD酶活性降低、MDA含量上升，说明TaHSP70突变后可以降低小麦的耐盐性；生物信息学分析发现，TaHSP70基因启动子区含有多个TaNAC019的结合位点，凝胶组织迁移率实验（EMSA）和双荧光素酶实验结果表明，TaNAC019蛋白体外可以结合在TaHSP70基因启动子区促进其表达；实时荧光定量和 TaNAC019 Crispr 转基因株系及超表达株系表型鉴定结果表明，TaNAC019 的表达受盐胁迫诱导并且 TaNAC019 能够增强小麦的耐盐性，因此推测TaNAC019可以参与到小麦的盐胁迫响应过程中；利用 mating 法筛选酵母 cDNA 文库，筛选到一个可能与 TaHSP70 互作的热激转录因子家族蛋白TaHSFA2；实时定量结果表明TaHSFA2基因在盐胁迫后 6 h表达量最高，说明 TaHSFA2 表达受盐胁迫诱导。TaHSP70基因多态性分析结果表明，D亚基因组相对于A和B保守性比较高，结合前面D亚基因组的表达量较高，因此我们推测在进化的过程中D亚基因组相对于A和B亚基因组功能更为重要。该项目研究结果不仅为小麦耐盐遗传改良提供了新的重要基因资源，而且为作物耐盐分子机理解析提供了参考。