灌木柳盐胁迫基因表达谱的解析和重要耐盐基因的鉴定

Salinity is one of the abiotic stresses that affecting plant growth and development. Currently the salinization of the 20% agriculture land of the world is increasing and by 2050, 50% of the land will become salinization..Therefore, cultivation of high quality and high salt-tolerant trees is of great socio-economic significance. Willow, having great varieties, is an important nectar trees and energy trees. In our country, willow is an important trees for afforesting deforested lands、saline land and an important component of timber production forest. Because of the short cycling、fast growth、blossom and fruit within one year, willow is thought to be a good genetic research material. To better understand the molecular mechanism and regulation pathway of salt-tolerant genes of shrub willow, we will analyze the salt induced gene expression profiles by using high throughput sequencing technology and screen the differential gene expression. Then the expression pattern of the differential gene expression will be verified. After the good candidate salt-tolerant genes are obtained, the function will be identified. This research will provide good molecular basis for cultivating new salt-tolerant willow species.

盐害是限制作物生长发育的主要非生物逆境之一。目前全世界大约有20%的农业用地盐碱化程度在不断加重，预计到2050年将会有超过50%的耕地会变得盐碱化。因此，培育耐盐碱的优质高效经济树种具有重要的社会经济意义。柳树种类繁多，是重要的早春蜜源树种、能源树种。在我国，柳树是绿化沙漠、水淹地和盐碱地的重要树种，也是用材林的重要组成树种。灌木柳生长周期短，生长迅速，一年内能开花结果，是理想的林木遗传学研究材料。为更好地研究柳树耐盐的分子机理、调控路径，全面了解柳树的盐胁迫应答响应的调控网络，分离出优良的耐盐基因，本研究将利用高通量测序技术对灌木柳盐胁迫响应基因表达谱进行分析，对差异表达基因进行筛选和生物学功能分析，对差异表达基因的表达模式进行验证，然后对重要的优良耐盐基因进行克隆和功能验证。为培育耐盐柳树新品种奠定分子基础和理论依据。

为了研究柳树不同时间和不同空间对盐胁迫响应的分子机理，本研究以灌木柳“苏柳2345”（S. × jiangsuensis CL ‘J2345’）为试验材料，采用RNA-seq技术对盐胁迫处理0h、2h、6h、12h、24h、48h的柳树叶片和根进行转录组测序，经组装拼接分别获得叶片约24亿条reads, 根约26亿条raw reads，经过滤，de novo组装拼接共获得127,397个unigenes。对叶片和根的差异表达基因进行功能注释和分类，发现柳树叶片和根在不同盐胁迫时间点富集不同基因。时序表达分析显示叶片和根部所有基因分别分为10种和14种表达模式。利用qRT-PCR技术验证了16个基因的表达趋势，其结果与测序结果趋势一致。通过对差异表达基因功能组群的划分发现叶片中的主要调控基因参与渗透调节、转录调控、植物激素等反应从而积累可溶性糖和增加细胞膜的透性来防止细胞失水从而使柳树叶片增强耐盐效果。根的调控基因主要参与植物渗透调节，离子平衡，ROS活性氧清除，信号转导。说明柳树根是通过SOS信号途径将Na+排出细胞外或者区隔进液泡内从而使细胞达到新的平衡。转录组的结果表明柳树的叶片和根的时间特异性和空间特异性的分子机理。选择叶片转录组中表达上调且表达量较高的柳树SjMIPS和SlChi基因进行分子克隆，根据生物信息学分析，推测SjMIPS基因编码蛋白具有肌醇⁃3⁃磷酸合成酶活性；SlChi基因编码蛋白为典型的第Ⅲ类几丁质酶。两个基因编码蛋白都与毛果杨同源蛋白的序列相似度最高、进化亲缘关系最亲。采用qRT-PCR技术检测盐胁迫后柳树SjMIPS基因表达模式，说明该基因是盐胁迫时间依赖型基因。利用农杆菌介导的方法对SlChi基因进行遗传转化研究获得阳性转基因株系。在盐胁迫时，过表达SlChi基因的拟南芥生长状态优于野生型拟南芥，转基因株系的种子萌发率远高于野生型植株，叶绿素含量的下降幅度少于非转基因拟南芥。SlChi为抗病基因，在本研究中提高了植物的耐盐性，为新基因的挖掘奠定了基础。本研究是第一次全面地、系统地阐述论证了柳树的耐盐表达调控网络，为今后新基因的挖掘，多重抗性柳树的培育，提供了坚实的理论基础和分子依据。