小麦高温响应转录因子TabZIP60的功能鉴定和调控机理解析

Heat stress is one of major factors limiting wheat yield and quality. Our previous study identified a heat responsive transcription factor TabZIP60 in wheat, whose RNAi plants showed heat sensitive phenotype. In this project, we will characterize the unconventional splicing pattern of TabZIP60 after heat stress and analyze their conservation during wheat polyploidization events. In addition, we will analyze the potential function of TabZIP60 in heat tolerance and identify its downstream and upstream regulatory network using its RNAi and overexpression transgenic wheats via genomics, bioinformatics, genetics and molecular biology methods. Specifically, to understand how TabZIP60 modulates wheat heat tolerance, we compared the transcriptomes of wild-type and the transgenic plants grown under heat stress conditions. By comparing the RNA-Seq results, the heat-responsive pathway will be identified. To further investigate whether TabZIP60 bound preferentially to cis-elements of downstream genes, we will perform the Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays under heat stress treatments. We also use the yeast two-hybrid system to identify potential TabZIP60-interacting proteins. After screening, the interactions of TabZIP60 will corroborate by bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Furthermore, the association between the genetic variations of TabZIP60 gene and heat tolerance will be evaluated using a diverse population of wheat consisting of 256 varieties from different regions. We hope to provide evidences for the molecular mechanism of heat tolerance in wheat. If the project is financially supported, we will publish 1-2 SCI paper, apply 1-2 patent and train 1-2 Ph.D students.

高温胁迫已成为严重影响小麦产量和品质的重要因素之一。本实验室前期克隆到一个小麦高温胁迫响应的转录因子基因TabZIP60，其抑制表达转基因株系耐热性明显降低。本申请课题拟以小麦TabZIP60的超表达和抑制表达转基因小麦及其受体为材料，综合采用功能基因组学、生物信息学、遗传学和分子生物学等研究方法，鉴定TabZIP60在高温胁迫前后可变剪切模式及其在小麦多倍化过程中的保守性，分析该基因在响应高温胁迫过程中的生物学功能、解析其上游和下游的调控途径，为研究小麦耐热性的分子机制鉴定基础。另外，对256份以不同来源的小麦微核心种质进行耐热表型性状分析，将TabZIP60序列变异和表达差异进行关联分析，筛选出最优等位基因，建立连锁的功能分子标记以期为小麦育种服务。发表SCI文章2-3篇，申请专利1-2项，培养研究生2-3名。

随着温室效应的不断加剧，高温胁迫已成为影响小麦产量和品质的限制因素之一。因此挖掘耐热相关基因并研究其作用机制具有重要的理论和实践意义。本研究在实验室前期工作的基础上，从小麦（Triticum aestivum L.）热胁迫差异表达谱数据中筛选到受热胁迫诱导表达的bZIP家族转录因子TabZIP60，对其参与耐热性的功能进行了研究，获得的主要研究结果如下：.1、小麦TabZIP60基因受热胁迫和二硫苏糖醇（DTT）处理诱导表达。TabZIP60蛋白保守结构域含有定位于内质网膜上的跨膜结构域。通过序列比对发现TabZIP60与拟南芥、水稻、大麦和短柄草中的bZIP60基因的序列同源性较高，并其mRNA能够形成相邻的茎环结构，预测小麦TabZIP60能被RNA结合蛋白IRE1剪切并通过实验得到验证。.2、为了研究TabZIP60的生物学功能，将TabZIP60（剪切前和剪切后的形式）构建超表达载体并转化拟南芥，发现剪切前的转基因株系的耐热性和内质网胁迫抗性与野生型相比没有显著差异，而超表达TabZIP60剪切后的形式能够显著提高耐热性和内质网胁迫能力。通过转录组测序分析，结果显示与野生型相比，在正常条件下转基因株系共有25个基因差异表达（Fold Change>2或<0.5，FDR<0.05），其中有19个基因与内质网胁迫相关；在热处理后转基因株系有17个基因差异表达，其中有7个基因与内质网胁迫相关。利用ChIP -PCR实验证明，TabZIP60D能与9个只含有ERSE-I元件的基因（BiP3、PDI9、PDI6、PDI10、bZIP60、BI-1、OS9和AT1G70490）。为进一步研究TabZIP60在小麦抗逆性中发挥的生物学功能，将TabZIP60基因构建RNAi载体并转化受体科农199，发现转基因株系与受体KN199相比，耐热性和内质网胁迫抗性显著降低。.3、克隆了TabZIP60的上游调控基因TaIRE1，通过在IWGSC网站的比对结果将其定位于小麦6A、6B和6D染色体长臂上，并通过qRT-PCR分析表明TaIRE1受热胁迫和DTT处理诱导表达。将TaIRE1基因构建RNAi载体并转化受体科农199，通过qRT-PCR分析证明，TaIRE1 RNAi植株热胁迫后TabZIP60剪切前后的形式相对于对照均显著降低。TaIRE1 T2代株