Filia泛素化修饰在胚胎干细胞遗传物质稳定性中的调控作用及其分子机理研究

The usefulness of pluripotent stem cells (PSCs) in research and therapeutic applications highly relies on their genomic integrity and stability. Our previous published study discovered that Filia is a embryonic stem cell (ESC) speicific regulator of genomic stability and is essential for embryo development. However, the mechanism is still unclear. Ubiquitination is reported to be an important player of genomic stability. For the reseason, we screened the ubiquitination of Filia and found that the ubiquitination of K141 of Filia resulted to the DNA damage, inhibited DNA repair and inhibited the translocation of Filia to the nuclei, which is key for safeguarding genomic stability by Filia. Thus, we infer that the ubiquitination of K141 of Filia mediated Filia translocated to nuclei and regulated the genomic stability. The following study will be performed to test the hypothesis:1) Study the effects of the ubiquitination of K141 of Filia on mESC genomic stability;2)Study the molecular mechanism of neclei translocation of Filia and genomic stability regulated by the ubiquitination of K141 of Filia; 3) Study the effects of the ubiquitination of K141 of Filia on embryo development. This study will identify novel key regulator and mechanism for genomic stability of PSCs.

维持遗传物质稳定性是多能干细胞（PSC）临床安全应用的重要前提。我们课题组已发表数据显示，Filia蛋白具有维持PSC遗传物质稳定性和胚胎正常发育的功能，但其调节机制尚不完全清楚。泛素化是调控遗传物质稳定性的重要蛋白修饰。本申请前期工作发现：Filia-K141R泛素化位点突变，抑制Filia入核，抑制DNA修复，造成小鼠胚胎干细胞（mESC）DNA损伤。我们推测Filia-K141位点泛素化是介导Filia入核并调控遗传物质稳定性的重要翻译后修饰。我们拟通过以下研究证实该假设：1）证实Filia-K141位点泛素化修饰对mESC遗传物质稳定性的调控作用；2）研究Filia-K141位点泛素化修饰调节Filia入核以及mESC遗传物质稳定性的分子机制；3）研究Filia-K141位点泛素化修饰对胚胎发育的影响。该研究将为PSC遗传物质稳定性的调控提供新的关键分子和作用机理。

多能干细胞在再生医学中具有巨大的应用价值，但是多能干细胞在长期培养过程中，遗传物质容易发生变异，是其向临床应用的一个瓶颈难题。我们课题组已发表数据显示，Filia蛋白具有维持多能干细胞遗传物质稳定性的功能，但其调节机制尚不完全清楚。研究表明，泛素化是调控遗传物质稳定性的重要蛋白修饰。我们通过筛选发现，Filia-K141泛素化修饰是小鼠多能干细胞维持遗传物质稳定的重要修饰。Filia-K141泛素化位点缺失，小鼠多能干细胞遗传物质不稳定，表现为DNA损伤加重，非整倍性染色体增加。多能干细胞的DNA修复和DNA复制叉的稳定维持需要Filia从胞浆进入细胞核。我们的机制研究表明，Filia进入细胞核受到Trip12和P38α的双重调控。 在DNA发生损伤时，多能干细胞停滞在S期，激活泛素化酶Trip12表达，并将Filia-K141位点泛素化，Filia-K141泛素化之后，Filia蛋白构象可能发生改变，暴露Filia-Ser349位点，募集P38α蛋白激酶，P38α进一步将Filia-Ser349磷酸化，Ser349发生磷酸化的Filia才能发生细胞核定位，发挥基因组保护功能。另外，我们在研究多能干细胞发生DNA损伤的过程中，鉴定了一个新的非编码RNA Discn, 发现其通过维持多能干细胞核质中游离RPA蛋白量，来保护干细胞基因组稳定性。Filia泛素化位点及其双调控因子的鉴定，是多能干细胞维持遗传物质稳定的新机制，可为改善多能干细胞的培养条件提供靶点，为其临床转化奠定理论基础。另外，Discn可作为报告分子，监测多能干细胞的培养环境，为筛选用于改善多能干细胞培养条件的化学分子提供分子标记。