苯丙氨酸羟化酶的泛素化修饰及其稳定性调控在BH4反应性PKU中的作用

Tetrahydrobiopterin(BH4)-responsive phenylketonuria(PKU) has been recently described as a variant of phenylalanine hydroxylase(PAH) deficiency caused by specific mutations in the PAH gene. Some authors proposed to elucidate its molecular pathological mechanism as a conformational disease in which impaired folding leads to rapid degradation of the affected polypeptides.We identified the five most common mutations and two new ones presumed to be assoociated with BH4-responsiveness in Chinese Han population and mapped seven PAH mutations onto the monomer of a composite model of PAH in our previous work. In this project, we will intend to explore following two questions from the perspective of the degradation of folding proteins①whether the ubiquitination of the mutant proteins occurs before the decrease of the corresponding enzyme activity②whether the increase enzyme activity is due to the reducing degradation of the ubiquitinated mutant proteins by adding the BH4 in COS-7 cells.By consturcting the expression vector of the involved seven mutations and analying the ubiquitination of their mutant poteins,we investigate the biochemical, degration rate and interaction between involved proteins, hoping to understand the impact of mutations on the ubiquitination and BH4-mediated stabilization in modifying the affected proteins in the cell, and provide some clues to the underlying pathogenesis and the potential therapeutic strategy for this disease and other genetic ones since similar mechanisms appear to be operative in all cellular compartments in which proteins fold.

四氢生物蝶呤（BH4）反应性苯丙酮尿症（PKU）是PKU的一种特殊类型，逐渐受到重视，但其致病机制仍不完全清楚。近年来，有学者提出从"蛋白质折叠病"的角度进行研究。我们前期对中国BH4反应性PKU患者进行了较大样本的分子流行病学调查，获得了BH4反应性的5种常见突变及2种新突变 ，并运用模型对它们进行了构象分析，获得了一些构象改变的依据。本课题拟从苯丙氨酸羟化酶（PAH）折叠降解的角度，探讨2个问题①突变蛋白在酶活性下降前是否存在泛素化修饰。②BH4是否是通过减少泛素化突变体蛋白的降解，提高酶活性。研究通过构建PAH基因突变表达载体，表达后观察突变体蛋白稳定性变化；对突变体蛋白进行泛素化分析，观察BH4对突变体蛋白稳定性的调控作用。期望通过所设计的实验深化对致病机制的理解，为国内PKU患者BH4替代治疗的系统化，个体化提供有力的实验依据，为其他类似疾病的治疗开辟新思路与新途径。

背景 2007年FDA批准二盐酸沙丙蝶呤片（Kuvan®）用于治疗苯丙酮尿症（PKU）或高苯丙氨酸血症（HPA），四氢生物蝶呤（BH4）反应性PKU成为PKU的一种特殊类型，其致病机制仍不完全清楚，导致系统的BH4治疗方法仍未建立，故难以推广。本课题对中国BH4反应性PKU人群的分子流行病学调查统计分析，并从苯丙氨酸羟化酶（PAH）折叠降解的角度，探讨BH4在提高两个错义突变体蛋白活性过程中的作用。.方法 1. 338例中国PKU患者，基因型，代谢表型确定；其中94个患者接受BH4负荷试验；患者的预测表型与其实际代谢表型之间行相关性分析；以负荷试验结果为金标准，评价两种基于遗传分析的BH4反应性诊断试验；分别运用两者预测中国BH4反应性PKU的发生率。2. 体外构建两个突变（A156P；P275A）的质粒；真核细胞表达后观察突变体蛋白稳定性变化；观察BH4对突变体蛋白稳定性的调控作用。.结果 1. 54.41%患者的实际代谢表型与其预测表型相符，一致率最高的是基因型由两个无效突变构成的患者（61.83%），最低是AV值和为5/6的轻型PKU患者（32.69%）；2. BH4 负荷试验示BH4反应性PKU发生率为51.06%；AV值和诊断BH4反应性的特异性及敏感性高于根据突变诊断BH4反应性的效能，AV值>2可以作为BH4反应性阳性的预测值；运用两种诊断试验推测中国人群BH4反应性的发生率分别为32.01%（AV值和）和25.80%（突变本身的BH4反应性）；3. A156P的mRNA水平有明显增加（P<0.05）；蛋白表达量均有减低（P<0.05）；细胞内加入MG-132后，两个突变蛋白表达上升；突变酶活性均下降，分别为 68.29%（A156P），36.72%（P275A），加入BH4后，突变酶活性有不同程度升高，并与BH4浓度成正比。.结论 一半左右中国 PKU患者代谢表型可以由其基因型预测；BH4反应性个体差异大；但是一些特异的基因型与BH4反应性之间一致性稳定；我们可以将这些特异的基因型作为中国人群BH4替代治疗的生物标记；细胞内突变体蛋白依赖泛素化途径降解，BH4对突变酶的稳定性具有调控作用。