青蒿PDR类转运蛋白参与青蒿素合成途径中代谢产物转运机制的研究

Artemisinin, isolated from Artemisia annua L., is widely used in the treatment of malaria. However, the artemisinin content in A. annua is relatively low. Previous studies showed that the artemisinin biosynthesis involved metabolites movement. But the mechanisms by which these molecules are transported remain poorly understood. Previously, we isolated AaPDR1, AaPDR2 and AaPDR4 from the glandular trichome transcriptome database in A. annua. These results suggested that the glandular trichome-specific transporter AaPDR1 was involved in dihydroartemisinic acid transport in artemisinin biosynthesis. AaPDR2 and AaPDR4 respectively promoted the artemisinin biosynthesis in transgenic A. annua plants. Based on these preliminary studies, we intended to verify the function of PDR transporters in A. annua and further reveal the transport mechanism in artemisinin biosynthesis via the transgenic A. annua plants analysis, xenopus oocyte expression system and the substrate binding analysis. Given the crucial role of transporters in metabolic engineering, determining to reveal the transport mechanism involved in artemisinin biosynthesisis important to improve the artemisinin yield both in planta and in yeast.

青蒿素是目前疗效最好的抗疟药物，其需求量大，但青蒿中含量极低。根据青蒿素合成部位的复杂性，可以推测青蒿素合成中存在代谢产物的转运，这些代谢产物转运机制的研究对植物代谢工程改良青蒿具有重要意义。但是青蒿素合成途径中代谢产物的转运机制尚未被报道。申请人前期筛选到参与青蒿素合成的PDR类转运蛋白（AaPDR1，AaPDR2和AaPDR4）。生物信息学分析，转基因青蒿基因表达，代谢产物分析和酵母突变体转运等实验暗示分泌型腺毛中特异表达的AaPDR1参与青蒿素直接前体物质二氢青蒿酸的转运；AaPDR2和AaPDR4也参与了青蒿素的合成。本项目拟在前期基础上，进一步通过亚细胞定位，爪蟾卵母细胞系统和目的蛋白与底物结合等实验探究候选转运蛋白的转运底物，揭示青蒿素合成途径中代谢产物的转运机制。该项目的实施将对利用代谢工程进一步提高青蒿素含量和异源合成青蒿素前体物质具有非常重大的意义。

青蒿素是从青蒿（Artemisia annua L.）中分离的倍半萜内酯化合物，是目前疗效最好的抗疟药物。青蒿素合成途径已经研究的比较清楚，而青蒿素合成途径中代谢产物的转运机制并无报道。本研究从青蒿分泌型腺毛转录组数据库中鉴定出89个ABC转运蛋白，通过进化树分析和不同组织的表达情况分析，筛选到AaPDR1转运蛋白基因。AaPDR1基因在分泌型腺毛中表达量最高；不同发育阶段的叶片表达分析证明该基因在幼嫩叶片表达量最高，随着叶片衰老，表达量不断降低；GUS染色结果证明AaPDR1基因只在青蒿的分泌型腺毛中表达。抑制AaPDR1基因的表达导致转基因青蒿中青蒿素，二氢青蒿酸和青蒿酸的含量显著降低；在过量表达青蒿植株中，青蒿素和青蒿酸含量显著提高，而二氢青蒿酸的含量大幅度提高，约为野生型对照的13倍。此外，酵母突变体转运实验证明AaPDR1在酵母中参与二氢青蒿酸的外排转运。这些实验结果证明AaPDR1很可能参与青蒿素合成直接前体物质二氢青蒿酸的转运。此外，本研究通过青蒿不同组织转录组数据库分析，系统分析青蒿ABC转运蛋白基因，从中筛选到在分泌型腺毛，根，叶片和花蕾中表达的AaABCG40转运蛋白基因。克隆该基因启动子驱动GUS转化青蒿，GUS染色证明AaABCG40转运蛋白主要在青蒿的根和叶片维管组织中表达；酵母转运实验证明，表达AaABCG40的酵母突变体AD1-8积累的ABA含量高于空载体对照；在青蒿中过量表达AaABCG40基因显著提高转基因青蒿中青蒿素含量和耐旱能力。此外，ABA处理过量表达AaABCG40基因青蒿导致CYP71AV1的表达量显著高于野生型。这些结果证明AaABCG40转运蛋白参与青蒿素中ABA的转运。