新疆双峰驼乳清蛋白抗肿瘤活性及其构效关系研究

Xinjiang is a major distribution area of the Chinese Bactrian camel, accounting for 52 percent of the country. In the traditional medicine of ethnic minorities in Xinjiang, there is a record of camel milk as an adjunctive treatment to inhibit tumor cell growth, but the ingredients of its anti-tumor activity and its mechanism is still unclear.In preliminary studies, we found that the Bactrian camel milk isolates can effectively inhibit the proliferation of esophageal cancer cells and induce its apoptosis. Consequently, this project is proposed 1) to further study the anticancer effect of active ingredient on human esophageal cancer in vitro and in vivo, and in-depth to explore its molecular mechanisms of inhibition of proliferation and induction of apoptosis. 2) to explore the effect of protein components on gene expression of ECa-109 tumor implanted to nude mice by Human gene-chip.This will provide clues for the further research. 3) to Identify the anti-tumor protein molecules in the camel milk by using proteomic research tools and study the relationship of its structure and anti-tumor function. This project will help to reveal the mechanism of the tumor suppressor activity of protein components in the camel milk. This research has great theoretical and practical significance on the development of special milk products with proprietary high-tech, high value-added, and health care function.

新疆是中国双峰驼主要的分布区，占全国52%。在新疆的少数民族传统医学中，很早就有记录表明：骆驼乳可作为抑制肿瘤细胞生长的辅助治疗手段，但其抗肿瘤活性成分的研究一直空白，作用机理尚不明确。前期研究中我们发现双峰驼乳分离物可以有效抑制食管癌细胞的增殖，诱导其凋亡。本项目拟在此基础上1）通过体外、体内实验研究活性蛋白对食管癌细胞Eca-109抑制作用，探讨其损伤肿瘤细胞线粒体，抑制其增殖和诱导凋亡的分子机制；2）利用基因芯片技术分析驼乳中活性蛋白组分对食管癌细胞基因表达谱的影响，为驼乳活性蛋白组分抗肿瘤机制研究提供线索；3）采用蛋白组学研究手段鉴定驼乳中的抗肿瘤蛋白分子，研究其结构与功效的关系。项目的实施有助于揭示驼乳抑癌活性蛋白组分的作用机理。对于开发具有自主知识产权的高科技、高附加值、具有营养保健功能的特种乳产品，具有重要的理论和现实意义。

新疆是中国双峰驼主要的分布区，占全国52%。驼乳具有一定的抗肿瘤活性和免疫增强作用，但其抗肿瘤活性成分与作用机理尚不明确，本研究对新疆双峰驼乳抑癌活性组分进行了筛选，在转录组和蛋白质水平上探讨了其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制，实验结果如下：.1. 新疆双峰驼乳清中抑癌活性蛋白组分的筛选 经分段盐析，当硫酸铵饱和度为35%-50% 时所得驼乳清组分TR35对Eca-109细胞在内的11株恶性肿瘤细胞的增殖均有抑制作用，其中对人食管癌Eca-109、人宫颈癌Hela、人结肠癌HT-29、小鼠Lewis肺癌LLC、人前列腺癌22RV1细胞增殖的抑制效果最好，而对人胃癌BGC-823抑制效果较差。TR35组分可诱导Eca-109 细胞的凋亡，且呈时间-剂量依赖性(P<0.01)；在光镜和电镜下出现典型的凋亡特征，荧光显微观察到凋亡小体；将驼乳清组分TR35采用DEAE-52以离子交换和凝胶过滤继续纯化，所得组分均无抑癌活性。经MALDI-TOF/TOF-MS对TR35进行鉴定：TR35为骆驼免疫球蛋白重链抗体和驼乳铁蛋白的混合物。 2.驼乳清抑癌活性组分诱导Eca-109细胞凋亡机制的研究 Annexin-Ⅴ/PI双染检测出现早期凋亡细胞；线粒体膜电位去极化，并将细胞周期阻滞在S期； caspase-3、9蛋白表达上调。结论：新疆双峰驼乳清蛋白组分TR35可抑制食管癌Eca-109等肿瘤细胞的增殖，并通过上调caspase-3、9表达诱导食管癌Eca-109细胞凋亡，推测TR35组分诱导Eca-109细胞凋亡的途径可能与线粒体通路有关。 3. 新疆双峰驼乳抑癌活性组分TR35诱导Eca-109细胞凋亡的分子机制 采用RNA-Seq、2DE- MALDI-TOF/TOF-MS 对处理24h的Eca-109细胞进行了差异转录组和蛋白质组分析。结合蛋白质组实验结果和RNA-Seq 的数据，对共同变化的12个蛋白进行了功能分析与验证，KEGG 代谢途径分析表明，很多基因富集在与肿瘤发生发展密切相关的信号通路上，如胰岛素信号通路、MAPK信号通路、PPAR信号通路、Jak-STAT信号通路等代谢通路。