高毒力肺炎克雷伯菌I-E型CRISPR-Cas系统内源性调控自身毒力的作用机制研究

High virulence is a defining feature of hvKP strains, however, the specific regulatory mechanism remains unclear. CRISPR-Cas system is widely distributed in bacteria and archaebacteria, against the invasion of viruses and exogenous DNA, and its function and application have attracted borad attention. Our previous study found that hvKP isolates were more likely to have I-E type CRISPR-Cas system than classic Klebsiella pneumoniae strains, and most of hvKP isolates that had positive I-E type CRISPR-Cas system were high virulent serotypes. Therefore, we assumes that the virulence of hvKP can be regulated by I-E type CRISPR-Cas system, as well as influence hvKP’s pathogenicity. This study is to construct CRISPR-Cas system mutant strain and the replenisher strain, and then infect the cells and mice, respectively, to confirm the effection of CRISPR-Cas system on the self-regulation of virulence in hvKP. Furthermore, mutant strain (Δcrp and Δcrp-Δcas3) and replenisher strain (c-Δcrp) were constructed, then virulence gene expression levels were detected, and cytotoxicity and animal experiments were carried out to elucidate the mechanism of CRISPR-Cas system in regulating the virulence of hvKP mediated by cAMP-CRP signaling pathway. The completion of this subject will find a new way to regulate the virulence of hvKP, laying the basis on further study of its pathogenesis, prevention and control of its transmission.

强毒力是hvKP标志性特征，然而，其具体的调控机制尚不清楚。CRISPR-Cas系统广泛分布于细菌和古细菌中，用以对抗入侵的病毒及外源DNA，其功能及应用已受到广泛关注。本课题组前期研究发现，I-E型CRISPR-Cas系统在hvKP中的检出率显著性高于cKP，且该系统阳性的hvKP大多为强毒力血清型。据此本课题假设该系统可调控hvKP毒力，影响其致病力。本课题组拟进一步构建CRISPR-Cas系统突变株及回补株，分别感染细胞及小鼠，通过体内、外实验以明确其在调节hvKP毒力中的作用。同时，构建突变株（Δcrp）、突变株（Δcrp-Δcas3）及回补株（c-Δcrp），检测毒力基因的表达水平，通过细胞毒实验及动物实验以阐明cAMP-CRP信号通路介导其调节hvKP毒力的作用机制。本课题的完成为调控hvKP毒力寻找一种新的途径，为深入研究其致病机理、预防和控制其传播奠定基础。

高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）是近年来发现的一种肺炎克雷伯菌的新型变种。同传统的肺炎克雷伯菌（cKP）相比，hvKP能导致免疫力正常的年轻个体致病，且感染后病情易于恶化，具有更高的致死率。近年来，其检出率上升，且耐药性逐渐增强，已给临床抗感染治疗带来极大的挑战。研究发现，强毒力是hvKP标志性的特征，该特征与其独特的血清型及表达多种毒力相关基因密切相关，如黏液表型调节基因rmpA、铁摄取系统kfuABC及气杆菌素基因aerobactin等。然而，到目前为止其毒力基因表达的调控机制尚不清楚。阐明其调控机制对于深入研究其致病机理，以及预防和控制其播散均具有十分重要的临床意义。. 本研究对临床分离非重复性的肺炎克雷伯菌进行了收集，采用MALDI-TOF MS对其进行鉴定，检测了其药物敏感性、耐药基因、毒力基因等，分析其同源性，大蜡螟检测了其毒力，并采用CRISPR-Cas9技术对相关基因敲除和回补，检测敲除前后及回补后菌株的毒力相关基因的表达情况。结果显示，共检出20株CR-hvKP，主要源于ICU。17株属于K2型。两种碳青霉烯酶基因被检出，blaKPC-2(13/20)和blaNDM-1(1/20)。20株CR-hvKP分为8种PFGE(A-H)，以A型为主；MLST结果示ST25，ST11和ST375被检出，以ST25为主，提示存在克隆传播。Δcas3菌株rmpA、aerobactin、kfu及allS等毒力基因的表达水平明显升高（升高倍数在4-9倍左右），c-Δcas3菌株中rmpA、aerobactin、kfu及allS的相对表达水平较野生菌株虽略有上升，但是较Δcas3菌株的下降。Δcrp菌株较野生菌株rmpA、aerobactin、kfu及allS的相对表达水平下降，其回补c-Δcrp菌株中，该4个毒力基因的表达水平基本上回到野生菌株的水平，当构建Δcrp-Δcas3菌株时，4个毒力基因的表达水平明显上升。. 通过以上的研究结果，得出CRISPR系统可通过cAMP-CRP信号通路调节hvKP的毒力基因表达。本研究的完成为临床合理选用抗菌药物、预防和控制其进一步播散及新的抗菌药物靶点的开发等均具有重要意义。