载TLR3配体的DC靶向壳聚糖纳米粒经粘膜及皮肤递送的研究

In the treatment of cancer and chronic infectious diseases, therapeutic vaccine has tremendous potential. Efficient excitation of CTL response against the target antigen is one of the key factors for the success of therapeutic vaccines. To select appropriate adjuvants is a practical strategy for improving the efficacy of therapeutic vaccines. Many ligands of innate immune receptor and their analogs have the potential of being effective adjuvants. Among them, the TLR3 ligand can efficiently activate CTL response and improve therapeutic effect of cancer vaccines and virus vaccines. But TLR3 receptor exists in a wide range of cells, direct use of poly(I:C) will lead to autoimmune and chronic inflammation. The other practical strategy for improving the efficacy of therapeutic vaccines is targeting immature dendritic cells, promote the phagocytosis of antigen and induce their maturation. This research will take receptor-mediated active targeting strategy, construct DC-targeting chitosan nanoparticles modified with mannose,DC targeting peptide or heat shock protein HSP70, encapsulate TLR3 ligand such as poly(I:C) and associated antigen (containing the CTL epitope), and will systematically explore the adjuvant effect,security and molecular mechanism of DC targeting chitosan nanoparticules loaded with drugs.

在癌症与慢性感染性疾病的治疗上，治疗性疫苗具有巨大的潜力。高效激发针对靶抗原的CTL反应是治疗性疫苗成功的关键因素之一。选择合适的免疫佐剂是提高治疗性疫苗疗效的一条切实可行的策略。众多天然免疫受体的配体及其类似物有成为高效免疫佐剂的潜力。其中，以poly(I:C)为代表的TLR3配体可以高效激活CTL反应，提高癌症疫苗或病毒疫苗的治疗效果。但TLR3受体在广泛类型的细胞内存在，直接使用poly(I:C)等易导致自身免疫与慢性炎症。提高治疗性疫苗的疗效的另一条切实可行的策略是靶向未成熟树突状细胞，促进其吞噬抗原，并诱导其成熟。本研究拟采取受体介导的主动靶向策略，构建甘露糖、DC靶向肽或热休克蛋白HSP70修饰的DC靶向壳聚糖纳米粒，包裹poly(I:C)等TLR3配体及相关抗原（含CTL表位），并对载药DC靶向壳聚糖纳米粒的佐剂效应、安全性及其分子机制进行深入系统地探索。

当今世界面临慢性非传染性疾病和传染性病症的双重威胁。在慢性病中又以癌症最受关注。在癌症与慢性感染性疾病的治疗上，治疗性疫苗具有巨大的潜力。高效激发针对靶抗原的CTL反应是治疗性疫苗成功的关键因素之一。选择合适的免疫佐剂是提高治疗性疫苗疗效的一条切实可行的策略。以poly(I:C)为代表的TLR3配体可以高效激活CTL反应，提高癌症疫苗或病毒疫苗的治疗效果。但TLR3受体在广泛类型的细胞内存在，直接使用poly(I:C)等易导致自身免疫与慢性炎症。. 树突状细胞在免疫反应的诱导过程中处于中心地位。靶向未成熟树突状细胞，高效诱导其激活成熟，预期将可提高免疫效果。以OVA为模型抗原，本项目设计了三条技术路线，即甘露糖修饰壳聚糖载OVA/polyIC纳米粒，DC靶向肽修饰壳聚糖载OVA/polyIC纳米粒及HSP70修饰壳聚糖载OVA/polyIC纳米粒。因受时间、资源与人力的限制，对前面两条技术路线进行了较为系统的研究，第三条只能待未来再进行。. 路线I：以真核表达质粒pEGFP为模型，研究了季铵化修饰壳聚糖纳米粒对DC的毒性及基因转染效果，证明控制修饰度可在高的转染效率与低的细胞毒性之间取得平衡；在此基础上制备了甘露糖化与季铵化双重修饰的壳聚糖并进行了确证与评价；探索了甘露糖修饰壳聚糖载OVA/polyIC纳米粒制备工艺并进行了优化及详细评价；优化了BMDC的制备方法并进行了确认；确认了修饰壳聚糖纳米粒对polyIC的保护效果及OVA/polyIC的释放性能；通过流式细胞术与ELISA方法确认了双重修饰壳聚糖载OVA/polyIC纳米粒对BMDC的激活效应；研究了双重修饰壳聚糖载OVA-Cy7纳米粒在细胞内的分捡效果；研究了双重修饰壳聚糖载OVA-Cy7/polyIC纳米粒体内转运，证明有一定缓释效果，并靶向传递到腹股沟淋巴结；通过体内CTL杀伤试验，双重修饰壳聚糖载OVA/polyIC纳米粒可有效激活针对靶抗原的CTL反应；进一步构建了小鼠B16/OVA肿瘤模型，确认了双重修饰壳聚糖载OVA/polyIC纳米粒具有良好的抗肿瘤效果。. 路线II：研究了DC靶向肽与壳聚糖的偶联方法；制备了DCpep-壳聚糖载OVA/polyIC纳米粒，并与上述类似进行了评价，发现其亦有良好的体内CTL激活效应与抗肿瘤效果。