外源性外泌体对mTOR通路参与柯萨奇病毒B3诱导细胞凋亡的调控作用及机制研究

Recent evidences corroborate that extracellular exosomes play a role in several biological processes, including inhibiting the cell apoptosis, activating PI3K/Akt pathway to enhance the cellular viability, participating in the viral pathogenesis, and so on. However, whether extracellular exosomes involve the regulation of the virus induced apoptosis is still an enigma. Given that our previous studies had performed that PI3K/Akt/mTOR signaling pathway participated in the Coxsackie virusB3 (CVB3) induced apoptosis, it is conceivable to consider that extracellular exosomes may take part in the CVB3 induced apoptosis via regulation of the mTOR signaling pathway together with the virus replication. To illustrate the hypothesis, in this study, extracellular exosomes will be added in the cells with or without the inhibitors of PI3K and mTOR or the overexpression of 4EBP1, p70S6K, Akt1 or Akt2 before CVB3 infection. Then, the change of the cytopathic effect and apoptosis in different infected time will be detected by transmission electron microscope. Furthermore, the change of the apoptosis and the PI3K/Akt/mTOR pathway will be investigated by the Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot analysis, respectively. Finally, we will examine the replication and release of CVB3, together with the change of the miRNA in exosomes at 24 h postinfected(p. i.). Our study will originally and preliminarily elucidate thepossible effects of extracellular exosomes in the CVB3 induced cell apoptosis, which may provide a new perspective of the mechanism and the development of new therapy of CVB3-induced apoptosis.

研究表明细胞外外泌体（Exos）在细胞增殖与凋亡、病毒感染性疾病等生物进程中发挥作用。但是Exos是否可调节病毒感染后诱导产生的细胞凋亡目前尚未见报道。课题组前期研究表明，mTOR通路参与CVB3诱导的细胞凋亡，且国内外研究显示Exos可以调控病毒复制及进出细胞并能作用于Akt通路而调控细胞凋亡等生命进程。因此我们推测Exos可能通过磷酸化mTOR通路、抑制病毒复制，从而减轻CVB3诱导的细胞凋亡。为证实此项假设，本研究拟构建mTOR通路抑制及过表达细胞模型，同时使用Exos及CVB3干预，通过检测凋亡因子、mTOR通路信号分子、病毒复制及释放以及Exos中miRNA变化等，观察病毒感染后不同时间点细胞凋亡、mTOR通路及病毒复制的变化，以初步阐释Exos在该通路参与CVB3诱导的细胞凋亡中的作用，为进一步研究CVB3诱导细胞凋亡的作用机制提供新的理论依据，同时为其治疗提供新的思路及靶点。

最新的研究表明心脏祖细胞（CPCs）的心脏保护效应与它们分泌的外泌体有关，使之成极具潜力的心脏保护和修复工具，但是其潜在的机制尚不明确。在本研究中，我们探究了CPCs所分泌的外泌体（CPCs-Ex）是否可以利用mTOR信号通路来减少CVB3感染诱导的细胞凋亡。在体外，我们将外泌体分别加入CVB3感染后的H9C2细胞，以检测CPCs-Ex的抗凋亡作用及其与mTOR信号通路的关系。与对照组相比，加入CPCs-EX的细胞凋亡率降低，同时病毒衣壳蛋白1（VP1）、Bim、Bax表达和caspase-9和caspase-3的裂解均降低，而BcL-2的表达却增加。并且CPCs-Ex促进了H9C2细胞中Akt，mTOR和p70S6K的磷酸化，但抑制了4EBP1的磷酸化。在向心肌炎大鼠模型体内注射了CPCs-Ex后，心肌细胞的凋亡、CVB3、和凋亡因子的表达以及Akt / mTOR因子的磷酸化的结果与体外一致。然后，我们使用雷帕霉素和MK2206抑制Akt / mTOR信号通路，同时将过表达4EBP1、p70S6K、Akt1、Akt2的四个质粒分别转染进H9C2细胞，建立稳定转染的细胞系。在感染CVB3后，将CPCs-Ex加入不同的组中。在雷帕霉素或MK-2206预处理组中，CPCs-Ex也能够降低H9C2细胞的凋亡和CVB3 mRNA的表达，同时也抑制了Bim，Bax，BcL-2的表达和caspase-3的裂解。但在雷帕霉素组中，CPCs-Ex在感染后48小时促进了VP1表达和4EBP1的磷酸化。在Akt2，p70S6K和4EBP1过表达组中，CPCs-Ex却加强了CVB3诱导的细胞凋亡，促进了VP1表达和caspase-3的裂解，并且在感染后48小时增加4EBP1表达。综上所述，CPCs-Ex通过可以通过激活Akt、抑制4EBP1的磷酸化、抑制BcL-2和caspase家族中的促凋亡因子三种途径，在CVB3感染的细胞中发挥抗凋亡作用。