Parkin蛋白的亚硝基化修饰对二价阳离子转运蛋白1的调控及其在帕金森病中的作用

Dopaminergic neurons lost and abnormal iron accumulation in substantia nigra (SN) have been found in Parkinson's disease (PD). S-Nitrosylation caused by nitrosative stress involved PD, including parkin. Parkin regulates metal transport via proteasomal degradation of bivalent metal transporter 1(DMT1). We have found that upregulation of DMT1 is one of the important reasons for the SN iron accumulation, but the mechanism is unclear. Regulation of DMT1 by SNO-parkin is meaningful for clarifying iron accumulation. Firstly, incubating cells with NO donor or NOS inhibitor to observe the effects of SNO-parkin on DMT1. Then, in vitro and in vivo with PD model, proteasomal inhibitor given and p53 silence was performed. The regulated mechanism of SNO-parkin on DMT1 was studied by two ways: ubiquitination and p53 dependent. Moreover, iron intake, DA neurons degradation, and exercise behavior were evaluated. This work will reveal how SNO-parkin regulates DMT1, and provide experimental data for clarifying the SN DMT1 increased, and the iron aggregation in PD.

帕金森病（PD）的主要病理改变是中脑黑质多巴胺（DA）能神经元丢失，伴有铁聚积。硝化应激引发的多种蛋白质亚硝基化（SNO）参与PD的发病及进展，其中包括parkin蛋白。Parkin蛋白介导了铁转运蛋白二价阳离子转运体1（DMT1）的泛素化降解。本课题组已发现DMT1高表达是黑质铁聚积的重要原因之一，但机制尚不明确。深入研究PD中SNO-parkin蛋白对DMT1的调控，对阐明铁聚积的原因具有重要意义。本研究首先在细胞模型给予NO供体或NOS抑制剂，观察SNO-parkin蛋白对DMT1的影响；然后在PD细胞和动物模型给予泛素化降解抑制剂或沉默p53，从泛素酶体降解和p53依赖两条途径研究SNO-parkin蛋白对DMT1的调节机制，并评价铁摄取、DA能神经元活性、运动行为学，以期揭示SNO-parkin蛋白对DMT1的调控机制，为阐明黑质DMT1表达增高、铁特异性聚积的原因提供实验依据。

二价金属转运体1（DMT1）水平升高引起的异常铁积累是帕金森病（PD）进行性神经退行性变的原因之一。Parkin是一种E3泛素连接酶，参与DMT1的泛素化修饰。S-亚硝基化parkin（SNO-parkin）在帕金森病中较为常见。然而，S-亚硝基化对帕金森病中DMT1泛素化的parkin的E3泛素连接酶活性的影响尚不清楚。为了阐明S-亚硝基化parkin和DMT1在PD中的作用，将parkin转染SH-SY5Y细胞，用S-亚硝谷胱甘肽（GSNO）和1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）处理。结果显示，转染parkin的细胞经GSNO和MPP+处理后，氧化型一氧化氮（NO）和S-亚硝基化parkin的水平升高。且DMT1、铁摄取和细胞活力的水平均增加。有趣的是，抑制S-亚硝基化parkin可以降低DMT1的水平。此外，parkin的S-硝基化显著抑制DMT1的泛素化。将parkin单点突变质粒（Cys241A，Cys260A，Cys323A）转染HEK293T细胞，DMT1的泛素化也受到抑制。然而，用含有这三种突变的质粒共转染的细胞，GSNO处理不影响DMT1的泛素化。这些结果表明，parkin的S-亚硝基化抑制了其泛素连接酶E3的活性，从而抑制了DMT1的泛素化，促进了PD中铁的积累和退行性变的过程。靶向蛋白的S-亚硝基化修饰可为PD提供一种潜在的治疗策略。