P小体标志蛋白GW182参与柯萨奇病毒B3型复制的机制研究

P-bodies play an important role in maintaining the dynamic balance of intracellular mRNA levels and the process of intracellular translation. Viral RNA can interact with P-bodies for transcription, translation, localization and degradation, as well as viral replication. Little is known about the role of the P-bodies marker GW182 during virus replication. Our preliminary data showed that the viral RNA of CVB3 could co-localize with GW182 protein in CVB3-infected cells，similar result was also found in the exosomes that from virus-infected cells. Knockdown of GW182 protein could inhibit CVB3 RNA replication. Therefore, we hypothesize that the GW182 is involved in CVB3 viral replication, as well as can affect the viral RNA release through exosomes pathway. We will test this hypothesis by using Co-Immunoprecipitation, RNA-pull down, CLIP-Seq and Transgenic and Knockout Animal models. We will investigate that (1)The role of P-bodies marker GW182 protein during CVB3 replication, as well as the molecular mechanism.(2) The function of GW182 in viral RNA release through exosomes process. This program will provide innovative evidence for how the virus uses the P-bodies marker GW182 to affect its own replication and the pathogenesis of extracellular transmission.

P小体在维持胞内RNA水平的动态平衡及翻译过程中发挥着重要作用，病毒RNA的转录、翻译、定位及降解过程能够与P小体相互作用，影响病毒复制。P小体标志蛋白GW182在病毒感染复制过程中的作用知之甚少。我们的预实验结果发现，柯萨奇病毒B3（CVB3）感染细胞后，病毒RNA能够与GW182在胞质中共定位，同时在细胞分泌的外泌体中也共定位；敲除GW182可抑制CVB3病毒复制。据此我们提出假说：P小体标志蛋白GW182能够参与CVB3病毒的自身复制，同时影响病毒RNA通过外泌体途径释放。围绕这一假说，我们将运用免疫共沉淀、RNA pull down、CLIP-Seq及基因敲除动物模型等技术手段，阐明1）GW182在CVB3病毒复制中的作用及分子机制；2）GW182在CVB3病毒RNA外泌体释放中的作用及病理意义。本课题将为病毒如何利用P小体标志蛋白GW182来影响自身复制和胞外传播致病提供新证据。

P小体在维持胞内mRNA水平的动态平衡以及胞内翻译过程中发挥着重要作用，GW182是P小体的标志性分子，对维持P小体的功能与完整性至关重要，因此，在病毒感染复制过程中很可能与GW182有相互作用。在本课题项目中，我们以肠道病毒CVB3为模型，探讨P小体标志蛋白GW182在CVB3病毒复制过程中的作用以及机制。我们的研究发现，CVB3病毒的感染能够显著的诱导宿主细胞内GW182蛋白表达增加并与病毒RNA 的复制水平呈现正相关性，同时，过表达宿主细胞内的GW182蛋白导致CVB3病毒复制水平显著增加，而抑制宿主GW182蛋白水平则表现出病毒复制水平受到限制；通过构建包含病毒基因组5’UTR序列的荧光素酶报告基因系统，结果显示，GW182能够结合在病毒基因组5’UTR序列中进而促进病毒的复制。重要的是，我们发现，GW182蛋白存在于细胞内的多泡体（MVBs）结构中，同时病毒RNA也定位于MVBs中，提示多泡体结构可能能够为病毒复制提供着位点、能量以及一些必须的酶类，从而有利于病毒复制。进一步的研究发现，CVB3的感染能够导致宿主细胞中多泡体的体积增大，并且诱导多泡体数量的增多，推测这为CVB3病毒复制提供更多的着位点。另外，在本项目研究中，我们发现，宿主细胞内GW182的敲除，导致CVB3病毒通过外泌体途径感染靶细胞方面的能力出现降低，提示GW182在辅助CVB3病毒外泌体途径感染方面具有重要作用。.本项目聚焦于P小体的核心蛋白GW182分子，首次揭示了GW182在肠道病毒复制中的作用，并且阐述其相关分子机制，进一步加深对GW182分子在病毒感染过程中功能的理解，为病毒与宿主之间的相互作用与博弈过程提供了新的分子靶点。