牛乳过敏原β-乳球蛋白低聚体的结构、稳定性及过敏性的研究

The oligomers of bovine beta-lactoglobulin are presented in fresh milk, which not yet attracted sufficient attention to the impact on the milk allergy. Bovine beta-lactoglobulin oligomer was prepared by purification, and its microstructure and conformational structure were identified by dynamic light scattering,electron microscopy and spectroscopic methods. Then, the stability of beta-lactoglobulin oligomer was explored by heating, acid and enzymatic treatment by simulating artificial gastrointestinal digestive juice. At last, the allergenicity of beta-lactoglobulin oligomer was evaluated by immnological experiment of histamine release capacity and IgE binding ability in vitro and animal experiment in vivo. .The work could probe the relation of structure change and the allergenicity of bovine beta-lactoglobulin oligomers, which hope to provide the theoretical basis for controlling the allergy of beta-lactoglobulin.

牛乳β-乳球蛋白形成低聚体是鲜牛乳中的一种自发现象，它对牛乳过敏性的影响尚未引起足够的重视。因此，本项目拟以天然存在的牛乳β-乳球蛋白低聚体为研究对象，分离并纯化β-乳球蛋白低聚体，进而采用动态光散射、电镜及光谱学等方法对其微结构和空间结构的特性进行表征。然后，通过模拟人工胃肠消化液，对β-乳球蛋白低聚体的热、酸和酶解的稳定性进行测定分析。最后，通过体外IgE结合能力和组胺释放能力的免疫学检测并结合体内的动物学实验进行评价，科学评估β-乳球蛋白低聚体的过敏性。.通过本项目的实施，将阐明牛乳β-乳球蛋白的结构变化与低聚体过敏性的关系，为控制β-乳球蛋白的过敏性提供新的理论依据。

本项目对牛乳β-乳球蛋白进行分离纯化并制备低聚体，检测其理化特性、酶解稳定性及致敏性的体内外评估，主要的研究结果如下：.1.乳清经色谱层析后，分别采用SDS-PAGE和质谱进行鉴定。在此基础上采用单因素实验确定最佳条件。结果表明，乳清经过两步色谱层析法分离后，能够纯化得到纯度高达99%的β-乳球蛋白；单因素实验结果表明，在温度为70℃，加热时间为0.5h，pH 7.0，金属离子与蛋白浓度比为1:1，该条件能较好地诱导β-乳球蛋白形成低聚体。.2.采用激光粒度的方法分析β-乳球蛋白低聚体粒径的变化，环境扫描电镜观察其外观形态，Ellimen法检测蛋白中的自由巯基含量的变化，圆二光谱法监测其二级结构的变化。结果表明，Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+四种金属离子诱导β-乳球蛋白聚合后的样品的平均粒径分别为372nm、1236nm、1167nm、315nm，他们在外观形态和二级结构上也表现出较大的差异，自由巯基的含量分别为0.026mM、0.04mM、0.033mM、0.04mM。.3.运用模拟体外胃肠消化的方式对诱导聚合后的样品进行消化，探讨β-乳球蛋白聚合后的酶解稳定性；用竞争ELISA法检测聚合后样品的IgG和IgE结合能力；免疫印迹观察聚合体的抗原性。实验结果表明，β-乳球蛋白聚合体抗胃蛋白酶消化能力较强，抗胰蛋白酶消化能力较弱；IgG结合能力为Zn2+>Cu2+> Mg2+>Ca2+，IgE结合能力为Cu2+> Ca2+> Zn2+ > Mg2+；免疫印迹结果表明β-乳球蛋白聚合体仍然有一定的抗原性。.4.通过Balb/c小鼠动物实验评估，结果发现β-乳球蛋白聚合物和β-乳球蛋白二聚体致敏的小鼠血清中IgG、IgG1特异性抗体和mMCP-1的水平明显高于β-乳球蛋白致敏的小鼠；同时，β-乳球蛋白聚合物和β-乳球蛋白二聚体致敏小鼠的脾细胞分泌的细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和血浆中组胺水平下降；而β-乳球蛋白二聚体致敏小鼠的脾细胞分泌的细胞因子IFN-γ水平升高。以上检测指标表明，β-乳球蛋白聚合物和β-乳球蛋白二聚体致敏性强于天然的β-乳球蛋白，即铜离子诱导β-乳球蛋白的致敏性增强。