柯萨奇病毒B3型入侵人神经细胞的动态过程及机制研究

Coxsackievirus B3（CVB3）is an important human pathogen which can induce a variety of diseases. CVB3 is able to infect human central nervous system (CNS) and establish persistent infection, causing permanent damage to patients. So far no cure is available for CVB3 infection. Despite the significance of CVB3 in human neurologic illnesses and the importance of infection mechanisms for antiviral research, no report about CVB3’s infection mechanism in neural cells can be found. We will use a Quantum-dots labeling and single particle trafficking strategy to study the infection mechanism of CVB3 in two neural cell lines, SK-N-SH cells in which CVB3 cause acute infection, and CCF-STTG1 cells in which CVB3 establish persistent infection, at the single virus particle level. The cellular entry and dynamic trafficking process of CVB3 in these two cell lines, especially the trans-membrane transport and vesicular transport process will be tracked, determined, and compared to elucidate the relativity between CVB3 cellular entry and virus infection state in neural cells. Our study will help to get a better understanding of CVB3-induced acute and chronic neuropathogenesis, and provide information and theoretical basis for anti-CVB3 research.

柯萨奇病毒B3型（CVB3）是一种能引起多种疾病的重要病原体。它能够感染人类中枢神经系统（CNS），并在部分神经细胞中建立持续性感染，对患者造成长期毒害，目前尚无针对CVB3的有效防治方法。明确CVB3的入侵机制是设计新型抗病毒药物的基础，然而作为一种重要的嗜神经性病毒，CVB3对神经细胞的入侵机制却没有相关报道。本项目拟使用量子点标记技术及单颗粒病毒动态示踪技术，从单颗粒水平解析CVB3对两种神经细胞（CVB3能够引起急性感染的SK-N-SH及能够建立持续性感染的CCF-STTG1）的动态侵染过程及入侵机制，重点阐明CVB3的跨膜转运方式及囊泡运输过程，探讨CVB3对神经细胞的入侵机制与感染状态（急性感染或持续性感染）的潜在联系。本项目的完成，有助于我们深入理解CVB3引起神经性疾病的致病机制，也为抗CVB3药物的开发提供新信息和理论基础。

肠道病毒3C蛋白酶在病毒生命周期中至关重要，因此是抗病毒药物针对的重要靶点，我们建立了可以准确、灵敏并批量检测肠道病毒71型（EV71）3C蛋白酶活性的生物传感器。此生物传感器由小鼠白介素1β前体（pro–IL-1β）、肠道病毒3C蛋白酶切割位点以及Gaussia Luciferase (GLuc)三部分组成，我们命名为i-3CS-GLuc。由于pro–IL-1β的易聚集性，传感器的Gluc催化活性被抑制，而EV71或其他肠道病毒，例如柯萨奇病毒A9(CVA9)、柯萨奇病毒B3（CVB3）和脊髓灰质炎病毒等可以识别切割位点，释放并激活GLuc的催化活性。这种传感器灵敏、简便、适用于活细胞且可以作为抗病毒药物的高通量筛选系统。. 我们也建立了一种囊膜蛋白标记量子点新方法，将SpyTag插入杆状病毒囊膜蛋白，使其可以通过易构肽与SpyCatcher修饰的量子点相互作用，从而完成病毒标记。这种标记方法十分简便且对于病毒感染性不会产生影响，因此是一种适用于病毒标记及感染示踪的良好标记方法。. 此外我们还建立了一种基于非天然氨基酸的，在天然代谢过程中对病毒进行荧光标记的新型策略。我们在病毒扩增的细胞中稳定表达一种甲硫酰胺转运RNA合成酶突变体MetRS，并外源加入非天然氨基酸L-azidonorleucine（ANL），MetRS可以特异性将ANL插入细胞新合成蛋白中，已获得EV71-ANL。ANL的侧链含有叠氮基团，因此可以和DBCO中的炔基发生点击化学反应，从而使病毒标记DBCO修饰的荧光染料或量子点。这种标记方法十分简便易行且高效，十分适用于无法融合荧光蛋白的小粒径病毒的荧光标记。