miRNAs介导Caveolin1基因调控副猪嗜血杆菌侵入后脑微血管内皮细胞迁移和通透性的作用机制

副猪嗜血杆菌是影响养猪业发展的重要病原，其感染导致的脑膜炎、败血症等是导致断奶仔猪死亡的重要原因，目前对其本身毒力因子研究较多，而宿主自身抵抗副猪嗜血杆菌感染的分子机制研究滞后。本项目是基于申请人前期发现细胞窖蛋白Cav1基因在副猪嗜血杆菌感染的脑中下调表达且该基因受miRNAs调控的基础上，拟通过体外培养的猪脑微血管内皮细胞（PBMEC）、仔猪活体细菌感染、过表达和抑制miRNA，电镜和流式细胞等实验检测miRNAs介导的Cav1基因表达变化对维持脑血管内皮细胞渗透性的结合相关蛋白JAPs（OZ-1，OZ-2，OZ-3和Occludin）和猪脑微血管内皮细胞表型的影响，探讨miRNAs介导的Cav1基因表达变化对脑微血管内皮细胞渗透和迁移的作用机制，解析副猪嗜血杆菌入侵猪血脑屏障的分子机制，结果可为阐明副猪嗜血杆菌感染的猪宿主免疫信号转导提供新线索。

疾病已成为现代养猪业的最大威胁，开展抗病育种特别是对抗病候选基因的挖掘是最为急迫的任务。在本实验室前期将猪Cav1基因作为一般抗病力的候选基因，研究了该基因的结构和转录调控机制，同时分析了该基因在副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）感染猪的过程中的表达变化规律，探究了该基因在Glasser’s病的发病过程中的作用机制。本研究探究了调控猪Cav1基因的miRNA在乙脑病毒感染PK15细胞中的作用机制，主要取得了以下结果：.1.用Targetscan在线软件预测、Q-PCR和Western blot检测验证了猪Cav1基因是miR-124和miR-199a-5p的靶基因。用免疫荧光染色的方法发现Cav1基因在PK15细胞中高表达并主要表达于细胞膜，推测PK15细胞的细胞膜上存在大量的caveolae。.2.在PK15细胞中转染miR-124模拟物，制作超薄切片并用透射电子显微镜观察细胞的caveolae结构，对细胞膜上的caveolae结构进行统计分析，和对照组相比，转染miR-124的细胞中的caveolae的数量显著减少（P<0.05），说明miR-124可以通过靶向caveolin-1降低细胞膜caveolae的密度。.3.在PK15细胞中转染miR-124模拟物后48h感染乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2，感染24h后检测JEV的增殖情况。Western blot和流式细胞仪检测结果表明，和对照组相比，超表达miR-124后乙脑病毒的增殖受到显著抑制（P<0.05）。.4.用去除细胞膜胆固醇的化学药物MβCD处理PK15细胞后再感染JEV，发现JEV进入PK15细胞依赖于细胞膜上的胆固醇。.5.本实验转染针对Cav1基因的siRNA的细胞中JEV的增殖受到轻微的抑制（约10%），通过实验发现JEV的侵入不是通过caveolae胞吞途径，而是通过网格蛋白（Clathrin）介导的胞吞途径进入细胞的。.总之，本研究拟在前期研究的基础上对猪Cav1基因的转录后调控做进一步的探索，但未在HPS感染过程中发现更有价值的结果，因此在研究过程中选择乙脑病毒作为感染材料，本论文工作为研究猪Cav1基因的转录后调控奠定了基础，对靶向猪Cav1基因的miR-124在乙脑病毒感染中作用的研究也为抗乙脑病毒感染提供了新的靶点。