猪ABCA1介导的巨噬细胞替代激活调控副猪嗜血杆菌感染的分子机制

Haemophilus parasuis (HPS) is the causative agent of Gl?sser's disease, whereas little is known about the molecular mechanisms that contribute to disease susceptibility/resistibility. Our group has firstly reported the host transcriptome differences and found that makers of alternative activation of macrophages including porcine ABCA1 were significantly up-regulated. We propose that "AAM happens due to HPS infection, which in turn causes susceptibility." Intriguingly, a [G/T] nonsense mutation was identified in exon21 of porcine ABCA1. Human ABCA1 has been reported playing key roles in AAM. Together with these, porcine ABCA1 may be a crucial player in Gl?sser's disease. To verify our hypothesis, both in vivo challenge and in vitro infection using monocyte-derived macrophage (MDM) will be performed in this study. Based on technologies such as flow cytometry, IHC, in-cell western, and RNAi, relationship of HPS and AAMs mediated by porcine ABCA1 will be discovered. Other objectives including the molecular regulation mechanisms of porcine ABCA1 in AAM and the susceptibility/resistibility of porcine ABCA1 [G/T] polymorphism to Gl?sser's disease will also be explored.

副猪嗜血杆菌（HPS）是猪格拉泽氏病的病原体，但宿主对该细菌易感/抗性的分子机制至今未知。我们曾首次报道了HPS感染的宿主转录组差异，并在前期研究中发现：感染导致发病猪中包括ABCA1在内的一系列巨噬细胞替代激活（AAM）标志分子上调表达，推测："HPS可诱导宿主巨噬细胞发生替代激活从而导致猪只易感"。同时我们还在猪ABCA1第21外显子发现一个对基因功能具有潜在重要影响的[G/T]无义突变，鉴于人ABCA1已被报道参与AAM的关键调节，提示猪ABCA1在HPS感染中扮演重要角色。为证实我们的假设，项目拟以ABCA1为切入点采用流式细胞术、免疫组化、RNAi、In-Cell Western等技术从活体感染和单核源性巨噬细胞（MDM）的体外感染模型两个层次揭示HPS与AAM的关系，深入研究HPS感染过程中猪ABCA1介导AAM的分子机制，探讨ABCA1[G/T]无义突变对HPS的易感/抗性。

HPS是猪中重大细菌性病原体之一。为深入揭示宿主巨噬细胞激活状态与细菌致病的关系及其分子机制，课题基于所提假设“HPS可诱导宿主巨噬细胞发生替代激活从而导致猪只易感”，以介导巨噬细胞替代激活的基因ABCA1为切入点进行了一系列研究。项目首先利用禁食初乳（CD）仔猪成功建立了HPS活体感染动物模型，QPCR和IHC检测证实：HPS感染早期猪肺部巨噬细胞发生替代激活，其中APOL3、YM1、TGM2是评判猪巨噬细胞替代激活的良好分子标志；组织表达谱分析显示ABCA1在免疫及免疫相关组织中存在较高表达，HPS感染后肺脏中ABCA1转录与STAT6存在显著正相关并于肺部巨噬细胞中显著上调，暗示可能密切参与HPS感染的机体免疫应答活动。因此，为揭示ABCA1调控巨噬细胞替代激活的机制、筛选宿主易感/抗性分子标记，研究进一步针对ABCA1基因第21外显子[G/T]无义突变进行了分析，然而对猪群基因分型后未能检出TT、GT基因型，推测该突变极有可能为一稀有突变，实际育种价值甚微。随后，我们利用RNA-Seq技术对HPS感染1dpi和3dpi外周血总白细胞的转录组变化进行了分析，分别鉴定到482个、1257个差异基因；注释发现，感染显著影响免疫细胞募集、吞噬等重要免疫应答，还鉴定一批与急性败血症、关节炎等HPS感染症状密切相关基因并进行了QPCR验证；此外，血液组织中IL-1、IL6、IL8、iNOS等巨噬细胞杀伤信号被显著激活，与此对应，1dpi血液白细胞中ABCA1反而下调，暗示单核/巨噬细胞更倾向于经典激活，以上说明：面对HPS感染单核/巨噬细胞的活化类型可能与其所处不同组织微环境有关。利用IPA深入分析发现，HPS感染后肺部巨噬细胞替代激活依赖IL4、IL13，而ABCA1-STAT6和ABCA1-STAT3是参与介导的基本分子信号，后续功能研究有待进行。以上原创性结果进一步深化了对HPS-宿主互作的认识。截至目前本项目发表论文3篇、授权国家发明专利1项、部分结果已参与申报并荣获省发明一等奖1项。