生物被膜形成基因luxS和PilA对副猪嗜血杆菌群体感应的调控机制研究

群体感应( quorum sensing,QS) 又称密度感应，是细菌通过分泌自体诱导物信号分子促进细胞之间交流和协调群体行为的过程。QS参与细菌生物被膜形成和对宿主致病性等多种重要生理功能。研究QS相关基因及其信号通路对阐明细菌的耐药性和慢性感染具有重要意义。副猪嗜血杆菌是给养猪业带来严重危害的格拉泽氏病的病原。本实验室研究发现，luxS和pilA是副猪嗜血杆菌生物被膜形成的关键基因。luxS是存在于多种细菌QS系统中的信号基因，pilA可能是QS系统的调节基因。本项目欲在已有的luxS和pilA基因缺失突变体基础上，通过副猪嗜血杆菌全基因组表达谱芯片，筛选出突变株和野生株之间的差异表达基因，研究副猪嗜血杆菌LuxS和pilA基因对其QS系统调控的影响，并采用同源交换构建出感兴趣基因的缺失突变体和相应回复株，对其进行功能验证，以期明晰副猪嗜血杆菌QS系统的信号转导通路及其调节机制。

副猪嗜血杆菌生物被膜形成与其耐药性产生和慢性感染有直接关系，并受群体感应系统（QS）的调控。研究副猪嗜血杆菌生物被膜形成相关基因luxS和pilA对其QS系统调控的作用，鉴定影响该菌QS系统的关键调控基因对于探明副猪嗜血杆菌QS系统的信号转导通路、阐明细菌慢性感染机制具有重要科学意义。本研究通过建立结晶紫染色试管法和微孔板法，分别对副猪嗜血杆菌生物被膜形成能力进行了定性和定量测定，并在此基础上，结合扫描电镜技术首次确定了副猪嗜血杆菌的生物被膜形成周期和周期不同阶段生物被膜的表型特征。之后，通过报告菌CV026和KYC55对密度感应信号分子AHL的检测确证了副猪嗜血杆菌生物被膜形成过程中存在功能性密度感应系统。随后，建立副猪嗜血杆菌信号分子AHL的提取方法，并成功从培养物中提取到AHL，经液质联用色谱检测确定提取物中存在质荷比（m/z）为256.2和284.4的两种AHL类物质，分别与AHL标准品C10-HSL和C12-HSL具有相同的母体m/z和酰基侧链m/z，但保留时间不同，推测检测到的AHL分别是与C10-HSL和C12-HSL组成相同、但结构不同的两种AHL。.通过批量测序50株副猪嗜血杆菌全基因组和直系同源比对，在基因组水平检测到种间密度感应系统的lsr型胞膜受体基因lsrB、RbsB、信号分子AI-2合成酶基因luxS和靶基因转录调节因子lsrR、luxR，以及调控运动的种内密度感应系统QseBC。同时检测到28个与生物被膜形成相关的基因，分别参与胞外多糖、脂寡糖（LOS）、Ⅳ型分泌系统、运动（motility）、粘附等表型形成及其功能作用。在基因水平推测出种间密度感应系统调控通路为：luxS基因诱导信号分子AI-2产生，经胞膜受体lsrB和rbsB将信号传递到胞内，通过激活或抑制转录调节子lsrR或luxR，启动粘附、Ⅳ型分泌系统（包含pilA）、胞外多糖产生和运动。种内密度感应系统通路依靠双成分调控系统QseBC，经由胞内受体luxR实现对运动的调控。另外luxS还可通过调控QseBC间接调节生物被膜形成。而荚膜位点分析显示该位点集中了密度感应系统调控的主要胞外多糖相关基因。最后，利用同源交换和抗性筛选策略，构建了RbsB基因突变株。