软骨分化过程中IGFBP4的细胞特异性动态表达模式及作用研究

How to effectively induce BMSCs chondrogenic differetiation and maintain chondrocyte phenotype is the key issue in cartilage tissue engineering. The process of in vivo chondrogenesis shows that the dynamic changes of proliferation and differentiation status are very important for chondrogenesis and chondrocyte phenotype maintenance. In the previous study, we found that the expression of IGFBP4 was higher in early chondrogenic differentiation stage than that in late stage.During cartilage development, the expression of IGFBP4 is high tissue- and stage-specific. And knockout of the IGFBP4 gene in mice showed an embryonic growth delay and significant reduction in body size. All these suggested a chondrogenic differentiation promoting effect of IGFBP4. However, IGFBP4 is a negative regulator of IGF action and can block IGF-induced cell proliferation. Little is known about the effects of IGFBP4 and its mechanism in chondrogenesis. In the present study, we will firstly examine the dynamic expression of IGFBP4 during chondrogenesis and elucidate the role and mechanism on cell proliferation and differentiation. Furthermore, we will establish a mathematical model, simulate the signaling pathway of IGFBP4 on cell proliferation ,chondrogenic differentiation and hypertrophic differentiation,and predict optimal doses and intervention timing. The results of the study may provide optimal methods to effectively induce chondrogenic differentiation and help us understanding the molecular mechanism of chondrogenesis and maintenance of chondrocyte phenotype.

高效诱导软骨表型稳定表达是推动软骨组织工程临床应用的关键。体内软骨发育过程提示细胞增殖与分化的动态变化对软骨分化和稳态维持非常重要。我们前期研究发现IGFBP4在软骨分化早期较晚期高表达。文献报道，其在软骨发育中的表达具有高度的组织和阶段特异性。且IGFBP4基因敲除小鼠胚胎发育迟缓，身材矮小。为明确IGFBP4在软骨分化过程中的具体作用及机制。本项目拟建立体外软骨分化模型，检测IGFBP4在软骨分化过程中的动态表达,及其调控细胞增殖与分化动态变化的作用及信号通路。进一步，利用微分方程建立数学模型,描述信号通路中各主要信号分子浓度关系，预测IGFBP4能够促进软骨分化，维持表型稳定的有效干预时机和作用浓度，并通过体内外实验证实其促进组织工程软骨构建的有效性。为建立高效诱导软骨表型稳定表达的方法提供技术参数，为深入认识软骨分化和维持表型稳定的机制提供新思路。

高效诱导软骨表型稳定表达是推动软骨组织工程临床应用的关键。体内软骨发育过程提示细胞增殖与分化的动态变化对软骨分化和稳态维持非常重要。我们前期研究中发现IGFBP4在软骨分化早期较晚期高表达。文献报道，其在软骨发育中的表达具有高度的组织和阶段特异性。且IGFBP4基因敲除小鼠胚胎发育迟缓，身材矮小。本项目以IGFBP4为切入点，从细胞增殖与分化动态变化的角度探讨能够促进软骨分化，表型稳定的方法和机制。研究中应用RCJ3.1C5.18细胞系建立软骨分化模型，证实在软骨前体细胞阶段增殖迅速，到软骨分化阶段增殖进入平台期，S期细胞减少，G0/G1期细胞增多，到肥大及成骨分化阶段，细胞凋亡增加。在这个过程中，IGFBP4在软骨分化过程高表达，在肥大和成骨分化阶段表达降低。通过过表达和敲减实验，证实IGFBP4能够促进软骨分化标志基因(Sox9、ColII)表达，抑制肥大分化标志基因（ColX、Mmp13）的表达；而且IGFBP4能够抑制细胞增殖，通过促进凋亡基因caspase3和Bax表达促进细胞凋亡。在机制研究中，明确了IGFBP4的作用途径包括IGF1依赖和非依赖两种方式，通过抗体芯片筛选和western blot验证证实IGFBP4可能通过PI3K/AKT信号通路达到抑制细胞增殖，促进软骨分化的作用。在应用研究中，首先检测证实人肋软骨细胞传代到第4代时IGFBP4表达降低，同时软骨标志性基因(Sox9、ColII)表达降低，通过在传代过程中添加IGFBP4,可以促进SOX9的表达，达到稳定传代过程中软骨细胞表型的作用。本项目研究为高效诱导软骨表型稳定表达提供技术参数；为明确软骨分化过程中细胞增殖与分化的动态变化，及其对软骨分化和稳态维持的影响和分子机制提供理论依据。