果糖软骨素合成路径的碳流流量调控及其机制解析

Chondroitin and its derivatives are one class of unbranched acidic polysaccharides with many special biological activities, which have been used in the medical, health product and cosmetic field. However, the biosynthetic pathway for chondroitin and its derivatives consists of several metabolic steps. When this multi-gene pathway is constructed, it usually gives rise to the inadequate and imbalance supply of precursors for chondroitin and its derivatives production, thus rsulting in low pathway efficiency. In this project, these bottlenecks for the production of fructosylated chondroitin are progressively solved to enhance the efficiency of producing fructosylated chondroitin by analyzing the bottlenecks in the biosynthetic pathway, enhancing the supply of precursors, and optimizing the balcane of precursors supply production. These research strategies and idea used in this project are not only useful for the construction of the metabolic pathway for the other carbohydrates, but also are academic value for the studies of novel strategies in metabolic engineering.

软骨素及其衍生物是一类具有多种生理活性的直链酸性粘多糖，被广泛应用于药品、保健品和化妆品等行业。然而，由于软骨素及其衍生物的生物合成路径步骤较多，容易引起前体代谢物供应量不足和供应比例失衡，造成路径合成效率较低。本项目拟采用路径模块化的方法，通过分析果糖软骨素代谢路径瓶颈、强化果糖软骨素合成前体供应量、优化果糖软骨素合成前体供应比例，逐步解除果糖软骨素合成的代谢瓶颈，提高果糖软骨素的合成效率。所采用的研究思路，进一步拓展了代谢流调节体系，对实现糖类化合物的高效合成具有一定的参考价值，同时对后续代谢工程新策略的开发也具有一定的借鉴意义。

硫酸软骨素是一类存在于动物组织中的硫酸化的糖胺聚糖，具有多种生物活性和药用价值。为了满足环境友好、生产安全的社会要求，微生物发酵法生产硫酸软骨素越来越受到人们的关注。大肠杆菌K4 (Escherichia coli K4) 生产的荚膜多糖是一种软骨素类似物，但是其产量、产率和生产强度较低不能满足工业化生产的要求。本项目通过优化E. coli K4中果糖软骨素（K4CPS）合成路径，提高了E. coli K4合成K4CPS的能力。.(1) K4CPS生物合成路径的构建。强化UDP-GalNAc、UDP-GlcA合成路径上的酶，有利于提高K4CPS的产量；融合PCR技术构建galU-pgm和glmM-glmS，增强了底物间的传输速率，提高了K4CPS的产量；蛋白质工程改造软骨素聚合酶KfoC，增强了KfoC与底物UDP-GalNAc和UDP-GlcA间的亲和力，最终K4CPS的产量达到了356.47 mg·L-1。.(2) K4CPS生物合成路径的组合优化。选择了K4CPS合成路径中的5个必需基因，将其划分为3个模块：(a) UDP-GalNAc模块；(b) UDP-GlcA模块 (c) 聚合模块。借助GFP报告基因，确定不同强度的RBS序列，低、中等、高表达水平的RBS序列；采用ePathBrick组装技术快速高效地将3个路径酶进行组装，成功构建了27个不同表达水平的质粒；模块路径工程策略优化3个模块的表达，实现了代谢流的平衡，当a、b、c模块分别为中等、低、中等表达水平时，K4CPS的产量高达521.62 mg·L-1。.(3)发酵优化提高K4CPS的产量。在5-L罐上采用DO-stat补料分批发酵模式，K4CPS的产量达到5.33 g·L-1，将上述控制条件应用于30-L发酵罐，K4CPS的产量进一步提高到了8.43 g·L-1。.通过上述研究获得了K4CPS的高产菌株，为发酵法生产硫酸软骨素的工业化奠定了基础，本研究所采用的研究思路和设计方法对于其他化学品的高效合成具有一定的参考价值。