肌细胞增强因子MEF2D增加肝癌细胞对EGFR抑制剂敏感性的分子机制

The activation of EGFR pathway plays an important role for the proliferation and survival of liver cancer, but the therapeutic effect of EGFR inhibitor is not desirable for clinical liver cancer treatment, which may be associated with the decrease in the dependence of liver cancer cells on EGFR signaling. We found that Myocyte enhancing factor 2D (MEF2D) is underexpressed in liver cancer cells resistant against EGFR inhibitor, and MEF2D restoration increases the sensitivity of liver cancers to EGFR inhibitor. In order to explore the molecular mechanism by which MEF2D promotes the response of liver cancer to EGFR inhibitor, we studied if MEF2D can enhance the dependence of liver cancer on EGFR pathway, with the help of biotechnological and bioinformatical approaches, as well as animal models and clinical specimen. Our study can contribute to the understanding of drug resistance of human cancers, and also provide evidence that MEF2D may be used to predict the efficacy of EGFR inhibitor on liver cancers.

表皮生长因子受体(EGFR)通路是肝癌分子靶向治疗的重要靶点，然而EGFR抑制剂对肝癌的临床治疗效果仍不理想，相关分子机制尚未完全阐明。我们发现肌细胞增强因子MEF2D在肝癌耐药细胞株中的表达量降低，过表达MEF2D可恢复肝癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性；基因芯片和生物信息学分析提示EGFR抑制蛋白MIG6可能受MEF2D负调控。我们推测肝癌耐药细胞株中MEF2D表达量下降促进了MIG6转录表达，削弱细胞对EGFR通路的依赖性，导致肝癌对EGFR抑制剂不敏感。本研究拟进一步研究MEF2D负调控MIG6表达的分子机制，验证MEF2D是否通过抑制MIG6转录增加肝癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性，通过动物模型和临床数据分析进一步确认MEF2D表达与EGFR抑制剂类药物疗效的关系。研究结果将有助于人们对肝癌耐药性形成机制的认识，也为选择MEF2D作为EGFR抑制剂治疗肝癌的预后分子标记提供依据。

目的 MEF2D是多种发育和生理过程中的一种转录调节因子，在肝癌细胞的增殖过程中起关键性的作用，但其促进肝癌细胞增殖和迁移的机制仍未清楚，本研究旨在观察MEF2D对肝癌细胞增殖和迁移的影响，并探究其是否通过负调控MIG6的表达发挥作用，是否与肝癌的耐药性有关系，是否可以作为肝癌的预后分子标记物。 方法 采用实时荧光定量PCR技术检测肝癌细胞系中MEF2D和MIG6转录水平的表达；使用siRNA在PLC/PRF/5细胞系中下调MEF2D和MIG6后，通过7Sea-CCK法和细胞划痕法检测肝癌细胞增殖和迁移能力；使用siRNA在PCL/PRF/5细胞系中下调MEF2D，使用MEF2D过表达质粒在SMMC7721细胞系中上调MEF2D后，通过蛋白印迹检测法分别检测MEF2D和MIG6的蛋白质表达水平。收集并分析了25例经EGFR抑制剂吉非替尼治疗的肝癌患者，比较了MEF2D高表达组和MEF2D低表达组的生存期差异。结果 以肝癌细胞系中MEF2D的mRNA表达量作为横坐标，MIG6的mRNA表达量作为纵坐标，制作线性相关图，发现肝癌细胞中两者的mRNA表达水平呈现负相关关系，线性相关系数R=－0.78。结果表明，下调siMIG6后，与阴性对照相比，24h和48h时PLC/PRF/5细胞增殖能力无显著变化，72h时PLC/PRF/5细胞增殖能力显著增强；下调siMEF2D后能显著抑制PLC/PRF/5细胞增殖能力。细胞划痕实验结果表明，与阴性对照相比，在48h时，PLC/PRF/5细胞siMEF2D组的细胞迁移率显著下降；PLC/PRF/5细胞siMIG6组的细胞迁移率显著上升。蛋白质印迹检测结果表明，与空白对照和阴性对照相比，PLC/PRF/5细胞下调MEF2D后MIG6蛋白表达水平显著上升；SMMC7721细胞上调MEF2D后MIG6蛋白表达水平显著下降。25例经EGFR抑制剂吉非替尼治疗的肝癌患者中，MEF2D高表达组（n=10）生存期的中位数是14.56个月，而MEF2D低表达组生存期的中位数是8.06个月，有统计学差异（P<0.05）。结论 结合前期的工作基础（详见标书），我们发现肝癌细胞MEF2D和MIG6表达量呈负相关关系，在肝癌细胞系中MEF2D通过负向调控MIG6的表达从而促进细胞增殖和迁移，MEF2D高表达的肝癌患者对EGFR抑制剂治疗的预后良好。