MicroRNA-29参与AMPK信号途径调节肝糖异生的作用及机制研究

AMPK signaling pathway plays an important role in hepatic gluconeogenesis. MiRNAs may play a certain role in it, while its regulation mechanism needs further research. Our preliminary study screened miRNAs involving in AMPK signaling pathway, and we found that the miR-29 family were negative regulated by AMPK activation. This project is intended to take C57BL/6 mice and its primary hepatocytes and ob/ob mice as research objects. Further analysis is to focus on how AMPK agonist AICAR can influence the expression of miR-29 under such different physiological and pathological conditions. Target genes by proteomics method combined with bioinformatics analysis of miR-29 were identified by luciferase reporter gene system. Analysis the molecular mechanism of miR-29 and its target genes mediated regulation of liver glucogeogenesis and its possible influence to insulin signaling pathway, verify the liver glucogeogenesis in the regulation of miR-29 in vivo and in vitro and related molecular mechanism with lentiviral system, and discuss the application mode of multiple target genes of miR-29. We want to found a new potential therapeutic target for diabetes by in-depth study of the molecular mechanism on the metabolism of liver glucose in regulation of miR-29.

AMPK对肝糖异生的调节发挥着重要的作用，miRNAs广泛参与能量代谢，miRNAs是否参与AMPK对肝糖异生的调节，尚未见文献报道。前期研究采用miRNAs芯片的方法筛选了AMPK通路调控的miRNAs，发现miR-29受AMPK信号通路负调控。本项目拟以C57BL/6小鼠及其原代肝细胞及ob/ob小鼠为研究对象，分析在不同生理病理条件下AMPK激活剂AICAR干预对miR-29表达的影响，通过蛋白组学结合生物信息学分析方法筛选与肝糖异生相关的miR-29的靶基因，以荧光素酶报告基因系统进行鉴定，探索miR-29及其靶基因介导AMPK调控肝糖异生的分子机制及其对胰岛素信号通路可能的影响，之后利用慢病毒系统在体内体外进行验证，并对miR-29的多个靶基因之间可能的作用方式进行初步探讨。希望通过深入研究AMPK信号通路中miR-29及其靶基因调控肝糖异生的分子机制，寻找治疗糖尿病新的靶点。

AMPK对肝糖异生的调节发挥着重要的作用， miR-29参与AMPK对肝脏葡萄糖代谢的调节作用，本研究以C57BL/6小鼠及其原代肝细胞为研究对象，以AMPK的特异性激活剂AICAR干预C57BL/6小鼠原代肝细胞，可明显抑制miR-29家族三个成员的表达，促进胰岛素刺激下磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）p85α亚基蛋白的表达及其下游Akt的磷酸化；应用生物信息学方法，预测PI3K p85α亚基可直接与miR-29 3‘UTR结合，在小鼠肝细胞中过表达miR-29b可抑制PI3K p85α亚基蛋白的表达和Akt的磷酸化，促进糖异生相关基因过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的表达，证实miR-29参与AMPK调节肝糖异生的过程。进一步观察在不同的喂养条件下miR-29和p85α的表达，小鼠禁食14h后，肝脏中miR-29三个成员的表达均明显升高，p85α mRNA和蛋白表达明显下降, 升高的miR-29和被抑制的p85α可抑制禁食状态下胰岛素信号的传导，在Hepa1-6肝细胞中重复上述实验得到同样的结果。使用芯片的方法筛选miR-29的靶基因，升高超过2倍的基因（两组干预组较对照组均超过2倍）有311种，228种基因明显下降，通过使用GO分析及KEGG分析表达水平下降的基因主要参与细胞外基质受体相互作用，蛋白质的相互作用，黏合斑和PI3K-AKT信号途径。进一步深入分析发现，在胰岛素调节糖原合成信号级联系统中重要环节的PI3K/AKT- GSK3β通路中，GSK3β可能亦是miR-29的靶基因，在小鼠肝细胞中过表达miR-29b可抑制GSK3β mRNA及蛋白的表达，提示AMPK通过miR-29调节肝糖异生的过程中，PI3K/AKT-糖原合成酶激酶3通路发挥重要作用，通过miR-29调节肝糖异生的过程并非只通过单一靶基因发挥作用。为进一步探讨miRNA与葡萄糖代谢及糖尿病的机制研究提供了理论和实验基础。