高效拆分2-芳基丙酸类手性药物的皱褶假丝酵母嵌合脂肪酶的研究

2-芳基丙酸类非甾体类抗炎药对映体的药理活性、作用机制及毒理具有很大差异，高效拆分其外消旋体具有很好的发展前景。脂肪酶能有效拆分对映异构性底物，但天然脂肪酶大多只具有部分立体选择性，其手性催化分子机理不明。因此，改造脂肪酶分子、提高其选择性，获得新型手性催化剂具有重要意义。皱褶假丝酵母脂肪酶已用于2-芳基丙酸类药物制备研究，但催化特性欠佳。为此，本项目拟以皱褶假丝酵母脂肪酶6条同工酶基因为研究对象，在优化基因稀有密码子的基础上，利用DNA家族改组技术定向进化，构建嵌合酶基因文库，流式细胞仪高通量筛选展示于酵母表面、对映体选择性大幅提高的嵌合酶，满足高效拆分2-芳基丙酸类药物的全细胞催化剂需求。此外，本项目还将通过预测嵌合酶结构，探讨脂肪酶与对映体选择性催化的分子机理。这将为脂肪酶优化与设计、脂肪酶与对映体选择性催化分子机理、2-芳基丙酸类非甾体抗炎药物开发奠定奠定科学基础。

生物酶法拆分外消旋体制备制备手性药物具有环保、产品单一等优点，是一种绿色工艺技术。然而，野生型脂肪酶存在对映选择性不高、酶活低、稳定性差等问题。提高催化活性、稳定性和选择性（包括化学选择性、区域选择性和立体选择性）为目的的脂肪酶分子改造具有非常重要的理论和实践意义。本研究以皱褶假丝酵母脂肪酶基因家族6条同工酶为研究对象，在优化非常规密码子和稀有密码子基础上，开展了皱褶假丝酵母脂肪酶基因家族的蛋白质定向进化，改组皱褶假丝酵母脂肪酶基因家族同工酶的DNA序列模块，构建高质量嵌合体基因文库，筛选获得3株具脂肪酶活力的阳性克隆, 但嵌合酶的立体选择性没有得到改良。结合全基因密码子改良，基因剂量效应调整、和分子伴侣共表达及过程控制等多策略，实现了CRL异源高效表达，重组子在10L发酵罐中的高密度发酵最高酶活力超过20000 U/mL；在此基础上，使用该酶对2-芳基丙酸类代表药物消旋布洛芬进行了立体选择性酯化的研究，制备了酶交联聚集体并采用了溶剂工程的方法提高了其对应体选择性，随后采用无载体固定化策略，制备CRL包衣微晶酶，研究其相对于游离CRL在酯化拆分布洛芬反应的催化特性；同时采用定点突变的方式改进了皱褶假丝酵母的热稳定性，获得TM值最大提高了9.40℃的突变重组子，使其能更好的适应工业催化过程。已发表SCI源刊论文22篇。