自噬性p62聚集活化泛素连接酶MDM2参与糖尿病肾病足细胞有丝分裂灾难的机制研究

Podocyte is the weakest link in diabetic nephropathy. Mitotic catastrophe implies that mitotic podocyte eventually detach or die, which is a previously recognized mechanism to proteinurine in an apoptosis-independent manner under diabetic nephropathy condition. According to our previous studies, the expression of p62 and the activation of MDM2 cascade signaling pathway in high glucose cultured podocyte and type 2 diabetes db/db mice kidney will be detected. We show that accumulation of the autophagy substrate p62 in db/db mice and high glucose cultured podocyte is associated with an incomplete formation of aberrant chromosome segregation and podocyte loss. The molecular mechanisms might involved in that p62 accumulation promotes podocyte injury by controlling the NF-κB-mediated induction of MDM2, which acts through p53-dependent and -independent mechanisms to abrogate checkpoints that accelerate proteinurine. P62 and MDM2 targeting may be useful for preventing diabetic nephropathy development. Furthermore, the value of diagnosis signature with the urine p62 and MDM2 expression as biomarkers for diabetic kidney injury will be evaluated.

足细胞是糖尿病肾病发生发展中最薄弱的环节，足细胞有丝分裂灾难可作为一种新的非凋亡性脱落和死亡的机制参与糖尿病肾病足细胞数量减少，导致蛋白尿的发生发展。在前期研究基础上，我们观察体外高糖培养的足细胞和2型糖尿病db/db小鼠肾组织中p62和MDM2的表达变化，探讨自噬性p62聚集能否通过影响E3泛素连接酶—MDM2表达，调控下游p53和Numb的泛素化降解程度，活化Notch1信号通路，诱导足细胞重新进入细胞周期，越过G2/M期检查点监控，足细胞发生有丝分裂性脱落和死亡，导致尿白蛋白排泄率进行性进展和肾小球硬化。探讨靶向调控糖尿病状态下p62和MDM2的异常表达能否减轻糖尿病肾脏损伤。验证结合尿液p62和MDM2的诊断标签能否成为糖尿病肾病无创性生物标志物。

本研究在体外培养的足细胞、肾小管上皮细胞、系膜细胞及2型糖尿病db/db小鼠肾脏中探讨自噬性MDM2活化并结合多种表观遗传学网络调控机制参与肾脏纤维化进展。首先本研究观察体外高糖培养的足细胞和2型糖尿病db/db小鼠肾组织中有丝分裂灾难现象，检测自噬水平，p62和MDM2的表达变化；检测下游Notch1的活性变化。向体外高糖培养的足细胞和2型糖尿病db/db小鼠转染MDM2敲除质粒，并加入自噬激活剂雷帕霉素，检测Notch1信号通路活性，观察足细胞有丝分裂情况和骨架蛋白重排情况，db/db小鼠尿白蛋白排泄率及肾脏病理损伤的改变，阐明p62/MDM2调控网络在糖尿病肾脏损伤中的作用机制。检测DN患者尿液中足细胞数量和异常有丝分裂比率，并检测足细胞标志蛋白、p62和MDM2的表达，探讨其作为DN诊断生物标志物的可行性。本项目进一步探讨表观遗传学在糖尿病肾脏纤维化中的作用机制，发现长链非编码RNA ARAP1-AS2通过调控其正义链靶基因ARAP1的表达，ARAP1通过竞争性结合CIN85，从而影响CIN85的表达，影响下游EGFR的泛素化降解水平，导致TGF-β/Smad3信号通路异常活化，从而影响肾小管上皮细胞的纤维化程度，参与糖尿病肾脏损伤。同时研究发现，体外高糖培养的肾小管上皮细胞HK2和2型糖尿病db/db小鼠肾脏中出现细胞焦亡，VX-765可通过抑制caspase-1活性，降低GSDMD剪切、抑制IL-1β的成熟和释放，降低胞质内容物LDH释放并减少焦亡细胞比率，有效改善糖尿病小鼠蛋白尿和肾脏间质纤维化程度，减轻肾脏病理损伤。使用m6A-mRNA&lncRNA表观转录组芯片检测两组患者肾组织中的m6A表达谱。结果发现，MDM2的m6A水平降低同时伴有其表达水平升高。提示MDM2转录本富含m6A修饰，可能存在m6A依赖的方式调控应激环境下MDM2的表达，参与肾脏纤维化。因此MDM2可能涉及到多种信号网络调控模式参与肾脏疾病的发生发展。