RNA结合蛋白TTP通过NF-kB/mTOR/p62调控肺腺癌细胞自噬的实验研究

Recently, RNA binding protein Tristetraprolin (TTP) is known to be functioned as a new tumor suppressor gene. However, its molecular mechanism is not clear. Research shows that TTP may be an important driven gene in the development of lung adenocarcinoma. Our preliminary results suggested that overexpression of TTP in lung adenocarcinoma cells did not induce cell apoptosis but cell autophagy. Thus we speculate TTP may regulate autophagy pathway to effect lung cancer cell proliferation and induce non-apoptotic cell death. To test this hypothesis, we intend to study the effect of TTP on lung adenocarcinoma cancer cell growth and proliferation, cell apoptosis, especially cell autophagy. In turn, to explore the role of autophagy pathway by interference autophagy in TTP inducing cell death. Furtherly, NF-kB as the breakthrough point, to make clear how TTP regulate autophagy through NF-kB/mTOR/p62 signal pathway. Finally, we will validate the effect of TTP on lung carcinoma in the nude mice model in vivo.To our best known, it is the first time to clarify the relationship between TTP and autophagy in lung adenocarcinoma. Our study will provide a new insight into TTP in lung cancer development.

RNA结合蛋白Tristetraprolin(TTP) 可作为抑癌基因发挥作用，但机制未明。其在多种肿瘤中低表达，已有研究表明TTP低表达可能是肺腺癌发生的关键驱动力。我们的前期结果提示：在肺腺癌细胞中过表达TTP显著抑制细胞增殖，但不引发细胞凋亡，却可诱导细胞自噬的发生。因此推测TTP可能通过自噬途径抑制肺癌细胞增殖及引发细胞死亡。本课题拟用肺腺癌细胞，通过过表达或基因沉默TTP表达，或利用抑制剂等阻断自噬途径，观察TTP表达对自噬的影响及自噬阻断对TTP抑制细胞增殖作用的影响；进一步探讨NF-kB/mTOR/p62这一信号途径的转导作用，以初步探究TTP调控自噬的分子机制；而后在裸鼠移植瘤模型中验证TTP通过自噬途径发挥抑癌作用。本项目通过体内外实验揭示自噬是TTP发挥抑癌作用的一个重要分子机制，将为TTP抑癌机制研究开辟一个新的方向，对阐明TTP在肺癌发生发展中的作用具有重要意义。

RNA结合蛋白Tristetraprolin(TTP) 可作为抑癌基因发挥作用，但机制未明。其在多种肿瘤中低表达，已有研究表明TTP低表达可能是肺腺癌发生的关键驱动力。本项目通过体内外实验揭示自噬是TTP发挥抑癌作用的一个重要分子机制。具体为：与正常肺上皮细胞 MRC-5 相比，肺腺癌细胞中的 TTP 表达水平低，其中 H1975 细胞最低，只有正常细胞的 10%表达量。 在 H1975 中过表达 TTP 后，CCK-8 结果显示细胞增殖被显著抑制，同时加入自噬抑制剂氯喹，可见抑制细胞增殖的作用更明显；透射电镜结果显示，TTP 24h 组与 TTP 48h 组的自噬泡数量均少于空载质粒对照组，其中 TTP48h 组的自噬泡显著减少。 自噬双标腺病毒（mGFP–RFP–LC3）感染后，免疫荧光结果显示，随着 TTP 表达上调，自噬体及自噬溶酶体数量显著减少。过表达TTP 48hr 后检测细胞周期显示,与空载对照组相比，TTP 过表达组的 S期细胞百分比从 27% 提升到 46%，显著增加了约 19% （P<0.01），同时伴随 G1 期细胞百分比的下降（P<0.05）。成功构建Dox 诱导调控的 TTP 过表达肺腺癌细胞模型，与 TTP 低表达组比较，Dox 诱导 TTP 过表达组明显抑制H1975、H1299 细胞增殖、迁移能力及集落形成能力。进一步研究显示：TTP 表达的上调能降低自噬基因Beclin1、LC3II 的表达水平。过表达 TTP 后，细胞核内的 p65 及 c-rel 蛋白表达较空载组及空载+TNF-α组减少（P 均＜0.05），但 p50 表达无明显变化（P＞0.05）；共转染 IκBα突变质粒及 TTP 过表达质粒后，自噬相关基因Beclin1、LC3Ⅱ-/LC3Ⅰ在 RNA 及蛋白水平表达较 TTP 过表达组升高（P 均＜0.05）。因此，TTP 在肺腺癌细胞中低表达，过表达 TTP 可能通过抑制NF-ĸB p65 及 c-rel 核移位而抑制肺腺癌细胞自噬。