抗白色假丝酵母菌融合蛋白治疗外阴阴道假丝酵母菌病的动物实验研究

Vulvovaginal candidasis is a common female medical problem. Prevention of recurrent vulvovaginal candidosis is a challenge to clinicians，which causes too much trouble in patients'daily life. Consequently, we constructed a recombinant fusion which is bactericidal against candida albicans.We have shown that a novel antifungal peptide was prepared by fusing α-mating pheromone of candida albicanst to the channel-forming domain of colicin Ia ,forming candida albicans pheromonicin(PMC-CA). Moreover, in order to prevent the recurrence of candidasis, we introduces lactobacillus which are dominant organisms in vagina tract. Here,the gene encoding PMC-CA was transfected into lactobacillus cells to forming the recombinant ones ,which were infused into the murine vaginal tract to colonization. At the meanwhile, by using an vulvo-vaginal candidiasis model in mice,the effect of this recombinant lactobacillus on vulvo-vaginal candidiasis was studied.We hope this recombinant lactobacillus producing the fungal targeting fusion peptide PMC-CA could be a novel alternative to conventional therapies used for vulvo-vaginal candidiasis.

外阴阴道假丝酵母菌病是育龄女性常见多发病。该病治疗后容易复发，是女性生殖系统感染性疾病治疗的难题之一。为许多妇女带来痛苦和烦恼。我们针对该病主要致病菌进行了前期研究，构建了一种新型抗白色假丝酵母菌的融合蛋白。前期研究证实：将白色假丝酵母菌α交配信息素和大肠菌素Ia形成融合蛋白(C-Ia-Ph-CA)后，能特异性地产生抗真菌作用。为了解决该病容易复发问题，我们提出利用阴道内健康优势菌群为乳酸杆菌的特点，将带有白色假丝酵母菌信息素与大肠菌素Ia连接形成融合蛋白基因的质粒，转染乳酸杆菌，并将重组后能产生C-Ia-Ph-CA的乳酸杆菌植入小鼠阴道内，建立其优势菌群，持续分泌C-Ia-Ph-CA融合蛋白，起对到白色假丝酵母菌原位防治作用。同时，建立外阴阴道假丝酵母菌病小鼠模型，用以观察重组乳酸杆菌对该病预防和治疗的情况。期望建立一种利用阴道健康优势菌群产生抗白色假丝酵母菌多肽，预防复发的新方法

本项目最初设想将表达融合蛋白C-Ia-PhCA的乳酸杆菌应用于外阴阴道白假丝酵母菌病小鼠模型的治疗。在实验过程中，我们将融合蛋白C-Ia-PhCA局部应用于小鼠阴道内进行抗真菌治疗实验时发现，其抗真菌效果不甚明显（见历年进展报告）。进一步研究发现这是由于我们的融合蛋白的抗真菌作用并不适合与阴道内特定的pH值。为了使该项目成果更加符合理想，项目团队经过仔细分析和讨论后发现天然抗菌肽Histatin-5（Hst-5）是一个很好的候选蛋白，Hst-5属于口腔内的天然免疫的第一道防线，是其他同家族蛋白的水解产物。经证实Hst-5在体内体外均有良好的杀灭真菌作用，而且它仅为24个氨基酸构成，结构较为简单，其杀菌作用不依赖于其构象的变化，受环境pH影响较小，因此抗菌肽Hst-5在阴道的酸性环境中是个较为理想的选择。最后我们决定将天然抗菌肽Hst-5增加为研究对象。.我们将人工合成的不同浓度的纯化Hst-5在培养基中与白假丝酵母菌ATCC10231作用，检测其体外的杀菌作用，同时也就将抗菌肽应用于霉菌性外阴阴道炎小鼠模型探索其在动物实验的应用价值。与此同时，将Hst-5的cDNA序列连接到能在乳酸杆菌中复制表达的质粒载体pPG612.1中。将构建好的质粒通过电转化转入乳酸杆菌ATCC393中。最后将成功表达抗菌肽的工程菌用于霉菌性外阴阴道炎小鼠模型，探索其治疗价值。.目前，我们已经成功验证了抗菌肽Hst-5在体外实验和动物实验的有效杀灭真菌的作用；在动物实验中，连续5天阴道局部使用20μM Hst-5或40μM Hst-5后，阴道的冲洗液中的霉菌数量有明显下降，与1mg的克霉唑治疗效果相当。另外，质粒构建已完成并成功转化进乳酸杆菌中，Western Blot结果显示工程菌成功表达抗菌肽Hst-5，现阶段，我们正将工程菌应用于霉菌性外阴阴道炎小鼠模型上。.纯化抗菌肽Hst-5在动物实验的成功，为我们在治疗真菌感染的策略上提供了新的思路。除了抗生素以外，我们可以充分利用天然物质，缓解病原菌对抗生素的耐药问题。此外，乳酸杆菌作为健康女性阴道内的优势菌群，在阴道内定植的乳酸杆菌通过表达抗菌肽，能有效抑制霉菌的入侵和繁殖，起到一级预防的作用，若将工程菌用于已发生霉菌性阴道炎的女性患者，可以起到治疗作用。