LpPLT1在华北落叶松体细胞胚胎发生中的功能及表达调控机制

Somatic embryogensis (SE) is a crucial tool for large-scale propagation , and also a model system for studying cell reprogramming and embryo development in conifers. In our previous study, PLT1 was identified to play an important role in the embryogenic capacity determination in early somatic embryogenesis in conifers. For further study, we will investgate the function of LpPLT1 in SE in Larix principis-rupprechtii Mayr and identify genes that respond to the overexpression of LpPLT1. Then, we will determine the temporal-spatial expression pattern of LpPLT1. Finally, we will explore whether DNA methylation and histone modification including H3K27me3 and H3K9ac are involve in the expression regulation of LpPLT1. In the course of the investigation, some important methods including gene overexpression, RNA interference, RNA in-situ hybridization, bisulfite sequencing PCR and CHIP-qPCR will be used with the aim to uncover the function and the gene expression regulation mechanism of LpPLT1 in SE in L.principis-rupprechtii Mayr.This study will provide new evidence for SE molecular study and lay the foundation for innovation and development of SE technology in conifers.

体细胞胚胎发生是针叶树规模化繁殖的重要途径，也是针叶树体细胞重编程及胚胎发育研究的模式系统。我们前期研究发现，PLT1很可能是针叶树体胚发生早期细胞胚性能力决定的重要调控因子。为了进一步探究PLT1在针叶树体胚发生中的作用机制，本项目拟以华北落叶松为研究对象，着重开展以下研究：（1）鉴定LpPLT1在华北落叶松体胚发生过程中的功能，挖掘PLT1的协同作用因子；（2）解析LpPLT1的在体胚发生不同组织中的时空表达特征；（3）明确DNA甲基化、H3K27me3与H3K9ac组蛋白修饰对LpPLT1的表达调控作用。本项目旨在通过超量表达、RNA干涉、RNA原位杂交、BSP克隆测序、CHIP-qPCR等技术方法的综合联用，阐明PLT1在针叶树体胚发生中的功能及表达调控机制。从而为以华北落叶松为代表的针叶树体胚发生的分子机理研究提供新的证据，也为针叶树体胚发生技术的创新发展奠定理论基础。

体细胞胚胎发生是针叶树规模化繁殖的重要途径，也是针叶树体细胞重编程及胚胎发育研究的模式系统。我们前期研究发现，PLT1很可能是针叶树体胚发生早期细胞胚性能力决定的重要调控因子。为了进一步探究PLT1在针叶树体胚发生中的作用机制，本项目在建立优化华北落叶松体胚发生技术体系的基础上，克隆LpPLT1基因的CDS全长及启动子序列，预测发现其启动子含有脱落酸、茉莉酸、赤霉素的植物激素顺式作用元件，表明该基因可能受到多种激素信号的协同调控。利用qRT-PCR检测发现LpPLT1在不同发育阶段体胚中特异性表达，并且子叶胚中高于胚性愈伤，表明LpPLT1可能在体胚发生后期发挥调控作用。基于农杆菌介导的遗传转化，筛选获得LpPLT1过表达细胞系15个，其中最高表达提高20倍；组织学观察发现，相比于同发育时期的野生型及空载株系，过表达细胞系组织胚头及胚柄细胞核大且致密，具有胚性能力提高的表型特征。对野生型与过表达细胞系开展RNA-seq分析，发现响应基因主要富集到植物激素信号转导、胁迫响应等通路，同时其高表达引起WOX、MYB、AGL等体胚发生发育相关转录因子的强烈表达响应，表明LpPLT1可能与其它转录因子协同作用响应或靶向调控植物激素信号。本项目研究结果为以华北落叶松为代表的针叶树体胚发生的分子机制研究提供了新的证据。