一种新型人源性药物转运载体HBD的跨膜机理及运载特性研究

具有治疗作用的药物分子在体内发挥作用的关键是如何实现有效跨膜转运进入细胞。目前用于携载药物分子的穿膜肽均来源于病毒或其他物种，临床应用可能存在安全性隐患，因此人源性穿膜肽的研究正成为关注焦点。我们在长期SOD基础和应用研究中发现人EC-SOD羧基末端肝素结合域（HBD）可能具有物质跨膜转运功能，经荧光显微和激光共聚焦观察以及药理实验证实，HBD确实具有跨膜转运药物分子的能力，并且对不同细胞的穿膜效率有显著差异，其跨膜转运分子机制有待阐明。本课题将重点开展HBD跨膜转运分子机理、对药物携载能力以及细胞特异性研究，通过内吞途径中关键分子如网格蛋白、细胞器标记分子如EEA1、Lamp1以及已知内吞途径的转铁蛋白分子等与HBD的定位观察，结合内吞途径抑制剂分析，阐明HBD内吞机制，并对HBD转运不同大小蛋白的能力及细胞选择性进行评价，为HBD作为一种新型人源性药物运输工具的应用提供科学依据。

本课题组首次发现了HBD可作为一种新型人源性穿膜肽应用于凋亡素蛋白的跨膜转运。为了将HBD开发成一种人源性药物跨膜运输载体，拟对HBD的跨膜转运机理、药物携载能力和跨膜细胞谱特性方面进行如下研究:.主要内容如下：.（1）穿膜途经：分别用多种内吞途径抑制剂和肝素酶进行处理，结果表明，与TAT网格介导的内吞不同，HBD呈现直接穿膜的方式。当HBD运载货物分子量增大时，入胞方式除了以能量依赖的直接转导方式为主以外，还部分依赖于内吞途径。.（2）穿膜效率：通过不同分子量大小的货物标签，确定了HBD运载药物能力最高可以达到90KD以上，运输效率随着货物分子量的增加而降低。该研究结果将有助于确定特定CPP所能携载的最适分子大小，确定了HBD可携载药物分子的最适条件。.（3）细胞谱特性：通过对10余种肿瘤细胞穿膜活性观察，表明HBD在穿膜性质上具有细胞广谱性，但不同的细胞类型，其穿膜效率存在差异。其中MGC80-3 和MKN45显示了较高的穿透效率，但HBD对5637 和A549 则表现出很低的穿膜效果。为HBD穿膜选择敏感型细胞进行药物运输提供了实验基础。.（4）胞内定位：小分子标记的FITC-HBD在作用1小时后快速定位到HeLa细胞核内，大分子标记的EGFP-HBD在作用10小时后仍然滞留于胞质，说明HBD具有明显的核定位效果，但运载大分子货物时，会明显降低其转运效率，为HBD携带药物分子的实际应用奠定基础。.（5）HBD免疫原性：对由HBD和TAT分别组成的融合蛋白进行的免疫原性分析结果表明，没有观察到两者之间在免疫原性上的区别。