MicroRNA在落叶松体细胞胚胎发生过程中的遗传调控

本项目围绕林学重要科学突出问题，在建立了针叶树体细胞胚胎发生体系的基础上，针对其分裂多胚及特有的PEM发育循环与SE形成时基因表达特性，利用已获得各种野生型与变异材料及新型miRNA技术，研究miRNA从启动细胞到生物体形成各关键环节正常表达以及相对于突变体的差异表达；通过反义RNA技术抑制这些在关键环节高度表达的miRNAs，来研究其生物功能；通过生物信息、基因芯片及其它手段，来寻找有生物功能miRNA的目标基因。在miRNA水平上揭示：（1）胚性与非胚性启动细胞发生机制；（2）PEMI到 PEMIII、PEMIII 到 PEMI以及PEMIII到SE中，同一细胞系野生型与突变型发育的原因；（3）ABA诱导后，从SE到 mature SE过程中，正常胚和畸形胚发生原因；（4）生物体正常生根和不正常生根原因；（5）合子胚与体细胞胚关键发育环节的差异，综合探索树木生长发育规律具重大理论意义。

利用建立的落叶松体细胞胚胎发生实验系统，在分子水平上研究从启动细胞到生物体形成关键环节的正常表达以及相对于突变体miRNA的差异表达；（1）利用miRNA芯片技术，研究了落叶松胚性细胞系从PEMI到PEMIII、PEMIII到PEMI以及PEMIII到SE增殖、成熟及转换过程中miRNA的差异表达，获得差异表达的miR156、miR164、miR171、miR159和miR166以及胚性与非胚性差异表达明显的miR171、miR159、miR169、miR172四个家族；筛选出生长速率明显不同的miRNA家族miR477g-3p、miR-675、miR1083、miR905*和miR171a。（2）利用高通量测序测定了落叶松干细胞转录组及小RNA数据库，鉴定出83个miRNAs及54个前体，预测了110个miRNA目标基因；鉴定了3个ta-siRNAs；分析了MIR位点通过变换切割位点产生lsi-RNA的规律、miRNA缩减体的产生机制及miRNA在不同发育阶段降解速率差异，系统分析了22个miRNAs的“isomer-Xs”比例和miRNA 3’端碱基添加对miRNA稳定性的影响。同时利用qPCR技术，分析了体细胞胚和实生苗中RDR2和RDR6的表达差异与小RNA长度分布间的关系；检测了落叶松ta-siRNA在不同发育阶段的表达模式；检测了17个成熟miRNAs、9个miRNA前体和11个miRNA目标基因在体细胞胚发育过程中的表达模式，发现成熟miRNA及其前体和目标基因间受多重调控，共同参与调控体细胞胚胎形成。（3）克隆了miRNA目标基因11个，并运用RLM-5’ RACE方法验证了16个目标基因，表明切割位点多位于第10与11碱基间。利用qPCR技术，检测了miR165/166的目标基因LaHDZ31、32、33、34在NPA处理体细胞胚发育过程中的表达模式，验证了miR171的目标基因LaSCL6和miR159的目标基因LaMYB33与细胞系胚性维持关系，分析了miR169的目标基因LaHAP2-1、2-2、2-3、2-4在无ABA处理的胚性细胞和正常体细胞胚发育过程中的表达模式，表明与体细胞胚发生的启动密切相关。本项目首次利用干细胞技术成功研究与揭示了针叶树生长发育关键环节miRNA的遗传调控，为同步化、规模化人工调控针叶树体细胞胚提供了科学理论依据。