毒物细胞应激反应途径识别和肝、肾靶器官毒性预测

化学品安全已成为国际和我国社会经济发展的重大问题。目前，因化学物毒性资料严重缺乏，化学物毒性测试已成为化学品健康危险评定和管理的瓶颈，急需突破。基金委即将召开主题为"化学品毒性测试新策略、毒作用机制和健康危险评定的研究"的"双清论坛"。基于此论坛主题，即化学品毒性测试新策略提出本项目。本项目将以毒理学研究比较充分的肝、肾毒物作为模型化学物，利用细胞应激反应主要途径关键靶基因启动子构建双荧光素酶报告基因质粒识别人源性肝、肾细胞对模型化学物的细胞应激反应途径，并在蛋白水平证实，同时进一步研究模型化学物诱导的细胞整合（Integrated）反应和细胞器毒性，从细胞应激反应→靶细胞/细胞器损伤→靶器官损伤研究的思路，以建立和验证基于细胞应激反应途径预测化学物肝、肾靶器官毒性的方法学，发展细胞系统毒理学及与肝、肾毒性终点相关的毒作用模式。为推进我国化学物毒性测试新策略发展提供依据和必要的方法学准备。

化学品安全已成为国际社会经济发展的重大问题。目前，因化学物毒性资料严重缺乏，化学物毒性测试已成为化学品健康危险评定和管理的瓶颈，急需突破。国外已有包括Tox21计划在内的多项研究计划致力于发展体外毒性测试新策略，其最终目标是发展毒物暴露新的相关模型以阐明毒作用机制和细胞事件，并预测人暴露的安全限值。基金委已召开主题为"化学品毒性测试新策略、毒作用机制和健康危险评定的研究"的"双清论坛"。基于此论坛主题，即化学品毒性测试新策略提出本项目。项目以毒理学研究比较充分的肝、肾毒物对乙酰氨基酚、氯化镉、二乙基亚硝胺和异硫氰酸-α-萘酯为模型化学物，测定其分别诱导人源性肝、肾细胞Hep G2和HEK 293T的细胞整合反应包括细胞增殖抑制和细胞死亡（凋亡和坏死），结果显示模型化学物抑制细胞增殖和诱导细胞死亡均呈剂量依赖性。通过分析模型化学物处理Hep G2和HEK 293T细胞24h的半数抑制浓度IC50和半数致死浓度LC50以及诱导细胞死亡的方式，发现模型化学物诱导模型细胞的细胞整合反应具有组织特异性。为识别模型化学物诱导模型细胞的应激反应途径，构建了含有转录因子Nrf2、HSF-1、p53、HIF-1、XBP-1、ATF6、ATF4、MTF-1、NF-κB、NFAT5反应元件的萤火虫荧光素酶的报告基因质粒，分别用于检测氧化应激、热休克反应、DNA损伤应答反应、缺氧反应、内质网应激、金属应激、炎症反应和渗透压反应。利用双荧光素酶报告基因检测系统测定模型化学物在LC20（引起细胞20%死亡的浓度）浓度下诱导Hep G2和HEK 293T细胞应激反应的时间-效应关系，结果显示模型化学物诱导模型细胞以时间-效应关系所表征的细胞应激反应模式不同，并表现出组织特异性。上述研究结果提示化学物诱导细胞应激反应模式和细胞整合反应的组织特异性可能是其靶器官毒性的重要机制，因此，从细胞应激反应→靶细胞损伤→靶器官损伤研究的思路，建立基于细胞应激反应途径预测化学物肝、肾靶器官毒性的策略在方法学上将是可行的。本研究不仅为推进我国化学物毒性测试新策略的发展提供了依据和必要的方法学的准备, 而且有助于进一步理解模型化学物肝、肾靶器官毒性的机制。