侧耳属真菌DNA条形码的选择与评价

DNA barcoding is a fast rising molecular taxonomic technique that uses a short stretch of standardized gene marker to quickly identify species.In previous studies we found that DNA barcoding method may successfully discriminate species in Nectriaceae family and Lachnum genus.The genus Pleurotus includes about 20 species.Species identification in the genus is ofen difficult due to the various and plastic morphylogical features,and thus there are a large number of synonyms and homonyms.For exploration of a rapid and accurate approach of Pleurotus species identification,ITS,28S,β-tubulin,EF-1α,RPB1 and RPB2 genes are selected as the candidate DNA barcode markers to investigate their feasibility in identification of 20 well-circumscribed species of this genus.Multiple approaches（intra- and inter-specific variations, frequency distribution of intra- and inter-specific pairwise distances, clustering at a given threshold, neighbor-joining tree reconstruction）are performed.The appropriate intra- and inter-specific sequence divergences and easiness of PCR amplification and sequencing are treated as important criteria to judge the suitability of the candidate DNA markers.The so-called Pleurotus species from the market and wild are determinated through the assigned DNA barcode for the genus.This project will facilitate the establishment of unambiguous Pleurotus species concept.In addition,this study will provide valid scientific proof in species identification of edible mushroom of the genus Pleurotus and data for the other mushroom and fungal DNA barcoding Program.

DNA条形码技术通过一个标准DNA片段对物种进行快速准确的鉴定，是目前生物分类学研究的热点。申请者的前期工作表明该技术可应用于丛赤壳科及粒毛盘菌属快速、准确的物种鉴定。侧耳属真菌全世界已知约20余种，因其形态特征多样且具可变性，出现较多的同物异名或同名异物。本项目拟以该属20个概念清晰的种为材料，以ITS、28S、β-tubulin、EF-1α、RPB1及RPB2作为候选基因，将种内与种间差异以及PCR扩增与测序成功率作为衡量标准，采用种内与种间序列差异分析、种内与种间距离频率分布检测、聚类分析物种鉴定成功率、邻接树重建等多种方法筛选侧耳属真菌DNA条形码。以市场来源和野生侧耳属材料为测试对象，评价选定的DNA条形码的效用。该研究将促进人们对侧耳属物种概念的认识，对揭示我国生物物种多样性与生物资源保护与利用具有重要意义，同时为食用菌鉴定提供科学依据，为其他真菌DNA条形码研究提供可靠信息。

在经典分类、物种多样性和生命树的研究基础上，DNA条形码成为当前生物分类学研究的热点之一。侧耳属真菌分布广泛，具有丰富的物种多样性和经济重要性，有些具有杀线虫作用，有些作为食用菌被广泛栽培，还有些可用于环境修复。因该属形态特征多样且具可变性，出现较多的同物异名或同名异物。实现对该类群快速、准确的物种鉴定，在潜在的生物防治资源发掘、食用菌生产、真菌物种进化理论的探讨等方面具有重要意义。.本项目收集和选取侧耳属物种概念清晰的菌株，扩增其ITS、28S、β-tubulin、EF-1α、RPB1及RPB2基因，采用多种方法分析上述候选基因在该属种内与种间差异以及PCR扩增与测序成功率，筛选该属真菌DNA条形码，并对选定的DNA条形码进行评价。研究发现DNA条形码可成功应用于该属真菌快速准确的物种鉴定。.经过三年的研究，基本完成了研究目标，并取得了如下研究成果：（1）通过对该属候选DNA条形码片段种内种间序列差异分析，发现EF-1α基因具有适宜的种内种间差异。除了Pleurotus pulmonarius 和 P. cystidiosus的种内差异大于该属最小的种间差异外，其余种的最大种内差异均小于该属最小种间差异。（2）通过构建该类群候选条形码基因邻接树，发现EF-1α片段的物种识别率高达84.6%。（3）通过对候选片段PCR扩增与测序成功率进行评价，发现EF-1α序列容易获得，PCR扩增与测序成功率为85%。ITS和28S分别为55%和70%。β-tubulin、RPB1及RPB2扩增及测序成功率低，需要设计特异性引物，因而不适宜用作该类群DNA条形码标识。（4）通过种内种间序列差异及序列是否容易获得这两个衡量标准，建议将EF-1α基因用于该属的DNA条形码。应用筛选出的EF-1α条形码，成功实现对平菇、杏鲍菇及榆黄蘑等食用菌快速准确的鉴定。项目执行期间已发表SCI论文1篇，会议论文1篇，申请国内发明专利3项（2篇文章已投稿SCI期刊，正在审稿）。