半胱氨酸脱硫酶基因调控香菇特征香味物质的形成机理研究

The unique aroma of Lentinula edodes is very important for its edible and commodity qualities. The volatile organosulfur compounds are the basis for the unique aroma of L. edodes. Cysteine desulfurase is the key enzyme in the metabolism of volatile organosulfur compounds in L. edodes. In order to solve the quality problem caused by less unique aroma of L. edodes, it is important to clarify the mechanism of cysteine desulfurase gene to regulate the formation of volatile organosulfur compounds in L. edodes. We have cloned the gene which encoded L. edodes cysteine desulfurase and found cysteine desulfurase gene influenced the volatile organosulfur compounds in vitro. In the present project, three genetic engineering strains of L. edodes will be constructed, RNA interference expression, over-expression and knock-out of cysteine desulfurase gene. The effects of expression levels of gene and enzyme activities of cysteine desulfurase on the generation of volatile organosulfur compounds in L. edodes will be analyzed. The upstream regulation sequences of cysteine desulfurase gene will also be cloned and analyzed. The response model of the upstream regulation sequence to environmental temperature will be analyzed. The function of cis acting element which responses temperature will be determined by deletion analysis and mutation analysis. We will clarify the effects of environmental temperature on the volatile organosulfur compounds in L. edodes. Our results will provide scientific basis for regulating the formation of the unique aroma in L. edodes.

香菇的特征香味是一个重要的食用和商品品质性状，挥发性有机硫化物是香菇特征香味物质的主要成分。香菇半胱氨酸脱硫酶是挥发性有机硫化物代谢途径中的关键酶，阐明半胱氨酸脱硫酶基因调控挥发性有机硫化物的形成机理对解决香菇特征香气不够浓郁带来的产品品质问题具有重要意义。申请者已经克隆出香菇半胱氨酸脱硫酶基因，通过体外重构活性酶蛋白实验证明半胱氨酸脱硫酶基因影响香菇挥发性有机硫化物的产生。本项目拟在此基础上，构建半胱氨酸脱硫酶基因的过量表达、抑制表达和基因敲除的香菇基因工程菌株，分析半胱氨酸脱硫酶基因表达量和酶活力变化对香菇干燥过程中挥发性有机硫化物产生量的影响。克隆半胱氨酸脱硫酶基因的上游调控序列并验证其功能，分析调控序列中响应温度的顺式作用元件的作用，揭示温度影响香菇挥发性有机硫化物产生量的机理。本研究对于从基因水平解析香菇特征香味形成问题，不仅提供有效的科学依据，而且具有重要的理论意义和实用价值。

香菇半胱氨酸脱硫酶是挥发性有机硫化物代谢途径中的关键酶，阐明半胱氨酸脱硫酶基因Csl调控挥发性有机硫化物的形成机理对调控香菇的香气形成具有重要意义。本课题通过分析基因Csl的表达量变化对挥发性有机硫化物产生量的影响，明确了基因Csl的功能；通过分析香菇干燥过程中基因转录表达水平的差异，确定香菇挥发性有机硫化合物代谢相关基因；通过分析基因启动子的功能，明确了温度对基因Csl表达的调控作用。本研究对于从基因水平解析香菇特征香味形成问题，具有重要的理论意义。主要研究结果如下：.（1）本研究构建了基因Csl的超量表达和抑制表达的香菇工程菌株。与野生型香菇相比，超量表达香菇中基因Csl的表达量升高了4倍，而抑制表达的香菇中基因Csl的表达量没有明显变化。与野生型香菇相比，超量表达的香菇子实体半胱氨酸脱硫酶的酶活力显著增加；香菇干制后，超量表达的香菇菌株有机硫化物含量显著增加。.（2）香菇热风干燥过程中转录组分析。选取0 h、2 h、4 h和6 h共4组样品进行转录组测序，分别命名为control组、treat1组、treat2组、treat3组。发现C-S lyase家族在香菇基因组中共有5个家族基因，Lecsl2和Lecsl3不仅在干燥过程中表达上调且在此期间保持高水平表达，推测Lecsl2和Lecsl3极有可能是C-S lyase家族中活跃参与含硫化合物产生的关键基因。.（3）基因Csl上游的启动子序列的功能分析。启动子序列中含有多个可能的热激转录因子结合位点。构建了启动子功能检测载体，表明克隆的基因Le-CS启动子序列可以驱动报告基因在香菇菌丝中表达，具有启动子的功能。通过热激处理，菌丝荧光强度明显增强，表明启动子中具有响应热激的元件。.（4）上游启动子序列中响应温度的顺式作用元件分析。构建不同长度的启动子截短序列功能检测载体，发现启动子中响应温度的顺式作用元件可能位于-500 bp至-400 bp的位置。构建启动子序列-500bp至-490bp的定点突变载体以及长度为-490bp的元件缺失载体，发现启动子中响应温度的顺式作用元件位于-500 bp至-490 bp。