线粒体ATP敏感性钾通道和与线粒体自噬对急性心肌梗死大鼠心肌细胞的影响与机制研究

With the large-scale construction of chest pain center in recent years, the application of emergency percutaneous coronary intervention (PCI) in acute myocardial infarction (AMI) has been greatly improved. The severe complications of AMI include heart failure, shock, and malignant arrhythmia, which are often occurred at the early stage. Therefore, it is particularly important to stabilize the function of the cardiomyocytes in damaged area during the period of waiting for the PCI treatment. After the occurrence of AMI, the ATP sensitive potassium channel (mitoKATP) is open and mitochondrial autophagy occurs in the corresponding necrotic region, thus protecting the function of cardiac myocytes. However, the study of the effect of the both on AMI myocardial cells and the related mechanism are still a blank. Based on the classic SD rat model of AMI, the study focuses on the effects of mitoKATP and AMI on myocardial mitochondrial autophagy pathway cells and the possible mechanism for the treatment of AMI, by controlling the opening and closing through diazoxide and 5-HD ,detecting protein expression level of LC3, Pink1, Parkin, Nix II and Beclin1 by Western blot technology,and the results are expected to provide a new target point and basic theoretical research.

随着近年来胸痛中心的大规模建设，急诊经皮冠状动脉介入术（PCI）在急性心肌梗死（AMI）的应用得到了大幅度的提升。AMI的严重并发症包括心衰、休克、恶性心率失常等极易在早期发生。因此在AMI发病而未能进行急诊PCI的这段时间内，如何稳定受损区域心肌细胞的功能显得尤为重要。AMI发生后在相应的坏死区域会出现ATP敏感性钾通道(mitoKATP)开放与线粒体自噬，从而保护心肌细胞的正常功能。但两者对AMI心肌细胞的影响以及相关机理的研究目前仍是空白。因此，本研究拟通过复制经典的AMI大鼠模型，应用二氮嗪和5-HD特异性调控mitoKATP通道的开放和关闭，同时采用Western blot与RT-PCT技术检测经典的线粒体自噬通路的LC3Ⅱ、Pink1、Parkin、Nix、Beclin1等蛋白水平与基因表达；成果有望为AMI的治疗提供新的靶向点位与理论研究基础。

探讨ATP敏感性钾通道开放与关闭对大鼠急性心肌梗死（AMI）心肌细胞自噬水平的影响。本研究首先使用SD大鼠建立急性心肌梗死模型，假手术组（Sham）只穿线不结扎，实验组选取4个时间点梗死0.5h、2h、4h、6h组（AMI 0.5h、AMI 2h、AMI 4h、AMI 6h）。穿线结扎左冠状动脉左前降支前后给予大鼠心电图检查观察心电图变化，再经腹主动脉采血，然后切取结扎线以下部位的心脏组织，用作下一步检测。氯化三苯基四氮唑（TTC）染色并计算观察心肌梗死面积，血清ELISA法检测心肌酶评估心肌损伤情况，HE染色观察受损梗死心肌病理结构并分级，Western Blot、免疫组化、qRT-PCR检测心肌组织自噬分子的mRNA及蛋白的表达情况。根据第一部分实验筛选出急性心肌梗死大鼠心肌细胞自噬达到高峰的时间节点，选取该时间点再次构建动物模型，按照处理因素不同，随机分为空白对照（Sham）、心肌梗死组（MI），MI+二氮嗪组(MI+DZ,)、MI+5-羟基葵酸盐组(MI+5-HD)、MI+DZX+LY294002（PI3K抑制剂）组(MI+DZ+LY), MI+5-HD+LY294002组(MI+DZ+LY)，各亚组的观察指标同前，再次用qRT-PCR测定 LC3、Beclin1、Bax和Bcl-2 mRNA 的表达，Western Blot 检测 LC3-Ⅱ、Beclin1、 Bax、Bcl-2蛋白的表达以及AKT、mTOR总蛋白及其磷酸化蛋白的表达。.结果发现，ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪可减轻MI大鼠心肌梗死及心肌细胞坏死，改善心肌组织结构；ATP敏感性钾通道抑制剂5-羟基葵酸盐的作用与二氮嗪相反，且2h为急性心肌梗死细胞自噬程度最高的时间点。二氮嗪后处理可能通过激活AKT/mTOR通路抑制MI诱导的过度自噬，减轻心肌损伤及凋亡，PI3K抑制剂LY294002可逆转此作用。.上述结果可揭示ATP敏感性钾通道与线粒体自噬在参与急性心梗细胞功能调控过程中的关联性，为寻找急性心肌梗死的早期用药靶点提供一定参照和帮助，具有很大的临床研究价值。