龙牙楤木总皂苷对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞线粒体ATP敏感性钾通道的影响

Protecting ischemic reperfusion injury is one of the urgent problems to be solved in the prevention and treatment of ischemic heart disease. The structure and function of mitochondria damage play an important role in the mechanism of myocardial ischemic reperfusion injury. Recent studies found that opening mitochondrial ATP-sensitive potassium channels (mito KATP) play a special role in protecting ischemia-reperfusion myocardium. This is an important therapeutic target in myocardial ischemic reperfusion injury. Previous studies also have shown the Aralsides has multi-targets in protecting myocardial ischemic reperfusion injury, and the specific mechanisms are not yet clarified entirely. This experiment copies myocardial ischemic reperfusion injury model by the way of clamping isolated heart left anterior descending artery of rats. To imitate the effective mechanism of ischemic post-process by the way of giving drug instantly at the time of ischemic reperfusion. With drug pretreatment as control, using methods and techniques such as transmission electron microscopy, laser scanning ，confocal microscope, ATP luminescence, Western blot, protein electrophoresis，we attempt to research the effect of Aralsides on ischemia and reperfusion injury of mitochondrial structure, mitochondrial membrane potential, mitochondrial ATP and mitochondrial cytochrome C. We hope to find that Aralsides can open mitochondrial ATP-sensitive potassium channel and we also need to clarify its mechanism of protecting ischemic reperfusion injury.

抗缺血再灌注损伤是防治缺血性心脏疾病中亟待解决的问题之一。线粒体结构和功能损伤在心肌缺血再灌注损伤机制中有重要作用，近年来研究发现开放线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道（mitoKATP）具有保护缺血再灌注心肌的作用，是心肌缺血再灌注损伤的重要治疗靶点。.既往研究表明龙牙楤木总皂苷抗心肌缺血再灌注损伤具有多靶点作用，具体机制尚未完全清晰。本实验通过夹闭大鼠离体心脏左冠状动脉前降支复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，利用缺血再灌注即刻给药的方法，模拟缺血后处理的效应机制，以药物预处理为对照，采用透视电子显微镜、激光共聚焦显微镜扫描、ATP发光、Western blot、蛋白电泳等方法和技术，研究龙牙楤木总皂苷对缺血再灌注损伤线粒体结构、线粒体膜电位、线粒体ATP、线粒体细胞色素C的影响作用。探讨龙牙楤木总皂苷是否具有线粒体ATP敏感性钾通道开放作用，阐明其抗缺血再灌注损伤机制。

随着PCI等冠脉再通技术的日趋成熟，临床针对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）采取的缺血后处理等技术作用有限，减轻梗死血管开通后的MIRI成为临床亟待解决的问题，目前尚无防治MIRI的有效方法。龙牙楤木为五加科楤木属植物，主要分布于我国东北地区，资源丰富，其根茎均可入药，味辛性平，具有益气活血、祛风除湿、安神止痛之功效，其提取物龙牙楤木总皂苷在前期研究中显示对大鼠MIRI具有一定的保护作用。本项目动物实验部分，成功制备大鼠Langendorff模型，并检测心脏血流动力学相关指标包括心率、左心室收缩终末压、左心室舒张终末压，左心室发展压、左室内压下降最大速率、左室内压上升最大速率、灌流液中心肌酶、乳酸脱氢酶含量，并制备组织标本进行HE染色、电子显微镜观察线粒体超微结构、提取纯化线粒体测定膜电位、ATP、钙离子含量、细胞色素C，测定心肌组织ROS、MDA、SOD、LDH、GSHPX含量，免疫组化法测定相关蛋白，结果显示龙牙楤木总皂苷对大鼠急性心肌梗死心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，开放mitoKATP对MIRI有保护作用，龙牙楤木总皂苷能够开放mitoKATP保护受损心肌；细胞实验部分，项目组通过建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，检测细胞存活率、凋亡率、MDA、SOD、LDH释放以及相关蛋白表达等，结果显示龙牙楤木总皂苷可以提高大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤后的存活率、降低凋亡率，减轻氧化应激损伤，其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路，开放mitoKATP通道，减轻过氧化损伤、减少线粒体细胞色素C释放、进而降低凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9等的表达、增加Bcl-2/Bax比例，减少细胞凋亡有关，总之，益气活血中药提取物龙牙楤木总皂苷对MIRI的多靶点保护作用具有重要的研究意义，对龙牙楤木总皂苷进行动物、细胞、分子层面的药理研究可为其未来可能的临床应用提供坚实的理论和研究基础。