EAAT2启动子基因多态性对中国人群难治性癫痫中兴奋性神经递质的影响及机制研究

The abnormal increase of excitatory neurotransmitter glutamate is the main reason for the occurrence of epilepsy. EAAT2 reuptakes 95 percentage of glutamate in the synaptic cleft released from nerve endings, thus terminates the synaptic transmission. The impairment of EAAT2 may cause damage of neurons and glial cells mediated by glutamate. EAAT2 gene polymorphism may change its expression and function, affecting the concentration of glutamate in the brain tissue, resulting in the reported failure of glutamate antagonists in certain patients. This research studies the drug resistant mechanism of refractory epilepsy from the perspective of genetic polymorphisms. First, determine EAAT2 gene polymorphism in blood with Taqman real time PCR method; secondly, measure the concentration of glutamate in blood and by HPLC ; finally, establish the association between gene polymorphism and glutamate concentration in the brain. lastly, EMSA is used to determine the effect of the polymorphism on transcriptional factors binding to the EAAT2 promoter. Therefore, EAAT2 promoter gene polymorphism plays an important role in the drug resistant mechanism of intractable epilepsy mediated by increased glutmate concentration.

兴奋性神经递质，谷氨酸的异常增加是难治性癫痫发生的主要原因。突触间隙的谷氨酸，95%由兴奋性氨基酸转运体（EAAT2）重摄取，EAAT2的表达与功能的损伤可增大癫痫病灶中由过量谷氨酸介导的神经兴奋性或细胞毒性，EAAT2启动子的基因多态性可能会改变EAAT2的表达。本研究通过Taqman real time PCR法测定血中EAAT2启动子的基因多态性；用Western blot 和免疫组化法测定脑组织中EAAT2的蛋白的表达；用HPLC法测定血浆中谷氨酸浓度，建立EAAT2启动子基因多态性与谷氨酸浓度的相关性，用EMSA方法分析基因多态性对转录调控因子与EAAT2启动子结合的影响。本研究对于阐明EAAT2启动子基因多态性导致由兴奋性神经递质异常增加介导的难治性癫痫耐药的机制具有重要的意义。

谷氨酸在胞外的大量蓄积是难治性癫痫重要的耐药机制，兴奋性氨基酸转运体EAAT2在维持细胞外谷氨酸浓度稳态中起重要作用。EAAT2启动子的基因多态性（SNP）降低该蛋白的表达，减少了谷氨酸的重摄取，增加了血浆谷氨酸浓度。虽然EAAT2启动子SNP与几种神经性疾病，如缺血性卒中、多发性硬化(MS)复发等中EAAT2蛋白表达异常相关，但目前还没有与癫痫相关的报道出现。本项目通过资助：分析了88例（男54例，女34例）成年难治性癫痫患者血清，67例（男32例，女35例）控制得好的成年癫痫患者血清，133例（男78例，女55例）正常成年人血清中的谷氨酸（GLU）、γ-氨基丁酸（GABA）、及谷氨酰胺（GLN）浓度。独立样本t检验分析显示，在这三组人群中，男女之间的血清GLU浓度、GABA浓度及GLN浓度都是有差异的，说明性别影响血清中GLU、GABA和GLN的浓度。单因素方差分析（one way ANOVA）分析发现，无论男性还是女性，成年难治性癫痫患者与成年控制得好的癫痫患者、成年正常人的GLU浓度的差异是显著的（P＜0.05），但成年控制得好的癫痫患者与成年正常人的GLU浓度无显著差异。三组男性之间的GABA浓度、GLN浓度没有显著差异，三组女性之间的GABA浓度、GLN浓度没有显著差异。描绘成年男性患者和成年女性患者的血清GLU浓度的ROC曲线，发现两组曲线下面积均大于0.8小于0.9，两组P均小于0.001，诊断准确性中等。成年男性患者和成年女性患者的截断值分别为164.09μM和142.71 μM。总之，血清GLU浓度被证明是诊断难治性癫痫的潜力生物标志物，亦有助于鉴别成人难治性癫痫与成人控制的好的癫痫。观察成年难治性癫痫男性患者和正常成年男性两组EAAT2启动子SNP的频率，经卡方检验，P＞0.05,故两组之间对的SNP没有显著差异，可见该SNP并没有增加罹患难治性癫痫的风险。将42例成年难治性癫痫男性患者EAAT2启动子位点不同基因型（A、C、A/C）对应的GLU浓度分成三组，进行单因素方差分析,结果显示，三组间的GLU浓度无显著差异。可见，EAAT2启动子SNP对成年难治性癫痫男性患者谷氨酸浓度没有影响，没有相关性。