sarcKATP通道在线粒体介导的脓毒症大鼠心肌细胞凋亡与自噬中的作用研究

脓毒症心功能不全与细胞凋亡和自噬有关，但脓毒症心肌细胞凋亡和自噬的调节机制目前还不完全清楚。我们前期研究发现脓毒症大鼠模型心肌细胞膜ATP敏感钾通道（sarcKATP）开放，动作电位时程缩短，可减少细胞内钙超载。细胞内钙离子载量直接影响线粒体钙含量，而线粒体在凋亡和自噬的发生发展过程中发挥着中心的作用。本课题以此为切入点，提出"脓毒症中被激活开放的sarcKATP通道可能通过线粒体钙介导，发挥对心肌细胞凋亡和自噬的调节作用"的假说。本研究拟于在脓毒症大鼠模型上，通过药物影响和基因沉默等方法，利用激光共聚焦显微镜、流式细胞术、分子生物学等技术，观察sarcKATP通道对心肌细胞线粒体Ca2+、细胞凋亡和自噬的影响，以及线粒体Ca2+在凋亡和自噬中的作用。掌握sarcKATP通道对细胞凋亡和自噬的调控机制，将有可能对脓毒症心功能不全的发病机制提出新的观点，有助于发现疾病新的治疗靶点和策略。

细胞膜ATP敏感钾通道（sarcKATP）自发现之初就被认为有重要的心脏保护作用，它能防止各种应激导致的钙超载及其随后的心脏损伤，从而达到保护心脏的作用。但sarcKATP对脓毒症心肌细胞凋亡和自噬的作用，以及与线粒体钙（[Ca2+]m）间的作用还不清楚。本研究运用了脂多糖（LPS）腹腔内注射诱导的脓毒症动物模型和LPS诱导体外培养的新生大鼠心肌细胞(NRC)损伤模型。结果发现：NRC暴露于LPS的刺激以后，细胞存活率显著下降，TUNEL法检测的凋亡、凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bax的表达均增强，Bcl-2的表达减弱，提示LPS能诱导心肌细胞的凋亡。特异性sarcKATP通道阻断剂HMR-1098促进心肌细胞凋亡，而特异性的sarcKATP通道开放剂P-1075可减少心肌细胞凋亡，线粒体钙单向转运体抑制剂钌红（RR）能部分抵消HMR-1098的促凋亡作用。在酶解法分离的脓毒症大鼠心肌细胞中，HMR-1098能加重脓毒症心肌细胞[Ca2+]m超载，而P-1075则能显著减轻脓毒症心肌细胞[Ca2+]m超载。为了证明sarcKATP通道产生的影响是通道本身的作用，排除药物可能的影响，本研究构建了携带Kir6.2（AAA）基因的重组腺病毒载体并将其在大鼠心肌细胞中正确表达，目的在于利用构建的点突变Kir6.2重组腺病毒，进一步转染心肌细胞，观察心肌细胞sarcKATP通道活性受到抑制后对细胞凋亡的影响。结果表明，显性失活基因Kir6.2（AAA）腺病毒感染后显著促进LPS诱导的心肌细胞凋亡。另外，在LPS诱导的心肌细胞损伤模型中，用Western blotting 方法分析自噬相关蛋白LC-3并定量，发现sarcKATP通道还可能通过下调LC3 表达而抑制LPS诱导的心肌细胞自噬。本研究所得结论：脓毒症心肌细胞模型中被激活开放的sarcKATP通道对脓毒症心肌细胞凋亡有保护作用，并有可能通过[Ca2+]m介导，发挥对心肌细胞凋亡的影响。该通道还可能通过下调LC3 表达而抑制LPS诱导的心肌细胞自噬。掌握sarcKATP通道对细胞凋亡和自噬的调控机制，将有可能对脓毒症心功能不全的发病机制提出新的观点，有助于发现疾病新的治疗靶点和策略。