经CRISPR/Cas9敲入CCR7基因的iPS细胞分化的调节性DC的体内迁移及其诱导免疫耐受的研究

Regulatory dendritic cell (DCreg) have an important role in maintaining immune tolerance, are believed to be used to treat autoimmune diseases and allografts rejection. However, in vitro generated DCregs, including the induced DCreg from iPS cells in our previous study rarely expressed CCR7 molecule, and their migration in vivo was inhibited. They were not easy to move into peripheral lymphoid tissues to regulate the immune reaction effectively. This shortage of in vitro generated DCregs limited their in vivo clinical application severely. Therefore, in this project, we are going to take the advantage of the editable property of iPS cells, use the latest development gene editing technology- CRISPR / Cas9 to knock-in the CCR7 gene into the mouse iPS cells to make the CCR7-specific iPS cells (CCR7-iPS). Then，we will explore the way to induce the CCR7-iPS cells into DCregs, to achieve the CCR7-iPS cells derived DCregs with CCR7 expressing stably, improve their migration to peripheral lymphoid tissues and make them play a role in the induction of immune tolerance. This project is starting from the practical problem using the derived source cells of DCreg to resolve the migrating difficulty. The results of this project will establish an important basis for clinical application of in vitro generated DCregs.

调节性树突状细胞(Regulatory Dendritic Cell, DCreg)因在维持免疫耐受方面的重要作用，被认为可以用来治疗自身免疫性疾病及移植免疫排斥。然而体外培养的DCreg，包括我们前一课题中成功诱导的iPS细胞由来的DCreg都极少表达CCR7分子，同时其在生体内的迁移受阻，很难迁至外周淋巴组织发挥作用，严重限制了体外培养DCreg的临床应用。因此，本项目设想结合iPS细胞可编辑的特性，利用目前最新发展的基因编辑技术CRISPR/Cas9将CCR7基因敲入小鼠iPS细胞，构建CCR7特异性iPS细胞（CCR7-iPS）。探索诱导CCR7-iPS细胞向DCreg分化，实现CCR7-iPS细胞由来的DCreg稳定表达CCR7，迁移能力提高，并发挥诱导免疫耐受的作用。本项目从实际问题出发，从诱导的源细胞入手解决DCreg的体内迁移问题，成果将为DCreg的临床应用建立重要基础。

本课题围绕多能干细胞的定向分化及应用开展了一系列研究。树突状细胞(DC)是专职抗原呈递细胞，外周免疫抑制作用的调节性树突状细胞(DCregs)，可以通过诱导调节性 T细胞等机制调节机体免疫状态，获取足量DCregs进行过继治疗为自身免疫性疾病的治疗开辟新路。我们针对iPS向DCregs的定向分化进行了系列研究。我们探索了新的体外诱导DCregs的方法。我们尝试了利用血管内皮生长因子、五羟色胺、甘草酸、甘草次酸、茯苓酸、GYY4137、二甲双胍等药物和化学成分，发现了5-氨基乙酰丙氨酸、五羟色胺和二甲双胍可能是诱导DCregs生成的有效药物。我们在iPS细胞向树突状细胞诱导分化的方法上进行了对原方法的改良，在保证细胞质量的前提下缩短了分化培养的时间，从而减少了培养的时间成本和材料成本和细胞污染的危险几率。我们利用小鼠的心脏移植模型探索了iPS由来的DCreg在生体内的功能，证实 iPS-DCreg可以诱导同种异体的移植小鼠心脏获得免疫耐受。另一方面，白癜风是一种常见的以黑素细胞缺失为表现的皮肤病，自身免疫紊乱攻击黑素细胞被认为是发病机制之一。因此，我们开展了利用干细胞技术从补充黑素细胞和抑制免疫反应两方面出发来探索新的治疗方法。我们对白癜风患者的外周血单个核细胞进行了检测，发现白癜风患者外周血中的CD11c+树突状细胞活化程度高于正常人，对针对性治疗的探索提供了理论依据；我们开展了iPS/ES向表皮细胞的定向分化，建立了无血清分化黑素细胞、角质形成细胞、成纤维细胞的新方法；成功构建了由ES分化的角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞合成的组织工程皮片；证实了ES/iPSC来源的黑素细胞免疫原性很低。我们构建了首个ES向黑素细胞分化的单细胞转录组图谱；我们通过实验验证了高剂量的EDN3与EDN1能够促进黑素细胞分化，EDNRA与EDNRB受体在黑素细胞分化过程中都有重要的作用。