利用报告基因和CRISPR/Cas筛选技术研究Wnt/β-catenin信号通路的下游调节机制

Wnt/β-catenin signaling is essential for embryogenesis and tissue homeostasis. Deregulation of Wnt/β-catenin signals can promote different types of human genetic diseases and cancers. In human tumors, hyperactive Wnt signaling contributes to the tumor initiation and development. Activating Wnt mutations occur frequently at the level of β-catenin destruction complex, result in constitutive activation of Wnt signaling that is no longer rely on the activation of the receptor complex at upstream. To block hyperactive Wnt signaling in cancer cells, one has to inhibit Wnt downstream activating mechanisms. Although β-catenin transcription complex is known to be critical in the downstream activation, no study has ever systematically investigated the other co-factors that are required for the downstream activation of Wnt signaling. Thus, study of downstream modulation of Wnt signaling will not only help us to better understand the pathway, but allow us to discover more drug targets for cancer therapy. In the proposed project, we will employ reporter gene and CRISPR/Cas-based screen techniques to identify signaling molecules that participate in downstream modulation of Wnt signaling. By integrating various experimental methods, the mechanisms how these molecules regulate Wnt signaling will be studied, and how they contribute to the properties of cancer stem cell will also be investigated.

Wnt/β-catenin信号通路对于胚胎发育和组织稳态维持起到关键性作用。Wnt信号通路的失调可导致多种人类遗传性疾病和恶性肿瘤的发生。在人类肿瘤中过激的Wnt信号通路对肿瘤发生、发展起到了重要的作用。激活Wnt信号的突变通常发生在β-catenin降解复合体水平，导致通路的激活不再依赖于上游受体的激活。因此，阻断肿瘤细胞内Wnt信号有效的方法是抑制其下游的激活机制。虽然已知β-catenin转录复合体是Wnt下游激活的关键之一，但还没有研究对Wnt信号通路下游激活过程中必需的辅助因子进行系统性的阐述。该类研究不但可以深化对通路本身的了解，也利于挖掘出更多肿瘤药物靶点。在本课题中，我们计划利用Wnt信号报告基因和CRISPR/Cas筛选技术发现参与Wnt信号通路下游调控的信号分子。通过整合多种实验手段，我们将研究所发现信号分子调节Wnt信号通路的机理，并研究其对肿瘤干细胞的作用。

Wnt/β-catenin信号通路对多种肿瘤的发生、发展都起到重要的作用。因此，为了开发针对Wnt信号通路的治疗手段，我们需要系统地了解Wnt信号通路的调控网络。本项目着重探索的科学问题包括：1）发现参与Wnt/β-catenin信号通路下游激活过程中新型的信号分子，2）阐明该信号分子调节Wnt/β-catenin信号通路的机制和对肿瘤细胞的作用。.本项目实施过程中，基于HEK293和SW480两个细胞系，我们建立了用于CRISPR/Cas基因敲除筛选的Wnt信号报告细胞系，并分别完成针对全基因组和核定位蛋白的基因筛选，以及相应的高通量测序工作。通过生物信息学手段对测序数据进行分析，我们获得一系列可正向或负向调控Wnt信号通路的候选基因，并获得实验验证。其中，能够正向调控Wnt信号通路的候选基因包括多个MED家族成员。我们初步分析候选分子MED10、MED12、MED27正向调控Wnt信号通路的作用机制。.此外，在构建SW480-Wnt信号通路的报告细胞系时，我们意外发现在SW480细胞中存在两群Wnt信号通路活性和EMT状态不同的细胞群。通过多种组学测序技术（mRNA-seq、ATAC-seq），我们发现了新型的能够影响细胞EMT能力的关键转录因子：RUNX2。实验证实RUNX2是Wnt信号通路的靶基因，其促EMT和肿瘤转移的能力能够在多种肿瘤细胞中以及小鼠体内重现。结合ChIP-seq实验，我们发现RUNX2 可直接诱导EMT相关基因的转录进而促进细胞的EMT过程。在临床数据中，在结直肠癌、胃癌、膀胱癌、肾癌以及神经胶质瘤患者中，RUNX2的表达与患者的生存率存在着较强的负相关性，预示着RUNX2在临床上具有重要的意义。.综上，本课题研究提示：1）MED家族对Wnt信号通路的激活起到重要作用，是潜在的药物；2）Wnt信号通路的下游基因RUNX2是重要的EMT诱导转录因子。