转基因细胞悬浮培养增殖α-生育酚的研究

针对天然维生素E生产中存在的产量较小和活性较低等问题，从拟南芥中克隆催化低活性γ-生育酚生成高活性α-生育酚的γ-生育酚甲基转移酶（γ-tocopherol methyl- transferase，γ-TMT）基因，构建γ-TMT基因表达载体，以果实中富含维生素Ｅ的黑莓为受体，通过农杆菌介导将该基因转入适宜的黑莓外植体细胞中，经过筛选，得到α-生育酚含量高、性状稳定的细胞株系，结合运用植物细胞克隆技术，获得稳定高产的细胞株，通过细胞悬浮培养，从最终培养物中提取得到富含α-生育酚的维生素E。本项目试图将基因工程的手段和细胞悬浮培养法相结合，以获得高产高效维生素E,研究结果可以为工厂化生产高活性天然维生素E开辟一条生物工程新途径。

本项目针对天然维生素E生产中存在的产量较小和活性较低等问题，从拟南芥中克隆得到催化低活性γ-生育酚生成高活性α-生育酚的γ-生育酚甲基转移酶（γ-tocopherol methyl- transferase，γ-TMT）基因，构建了γ-TMT基因表达载体，并以果实中富含维生素E的黑莓为受体，通过农杆菌介导将该基因转入适宜的黑莓外植体细胞中，经过筛选，得到α-生育酚含量高、性状稳定的细胞株系，结合运用植物细胞克隆技术，获得稳定高产的细胞株，通过细胞悬浮培养，从最终培养物中提取得到富含α-生育酚的维生素E。.对项目组保藏的12个黑莓品种样品考察后，选定‘Kiowa’品种作为对象，研究适宜的外植体愈伤诱导条件。研究显示，研究了培养基成分和外源生长调节剂对愈伤组织诱导的影响。结果表明，培养基种类、糖种类、蔗糖浓度、激素种类、2,4-D浓度以及水解酪蛋白浓度等因素对愈伤组织的诱导均有影响，其中以MS作为基本培养基、25 g/L蔗糖作为碳源、pH 6.0、附加1.0 mg/L 2,4-D及200 mg/L水解酪蛋白诱导的愈伤组织呈嫩黄色颗粒状，质地疏松，生长势佳，适宜进行细胞悬浮培养。.从拟南芥中克隆了γ-TMT基因，并构建了含有γ-TMT基因的植物表达载体pBI121-TMT，并将其导入根癌农杆菌EHA105中，获得了可用于遗传转化的γ-TMT正义基因工程菌，制备用于侵染转化的工程菌液，对预培养后的黑莓愈伤组织进行侵染。对侵染后的愈伤组织样品分别进行PCR和RT-PCR分子鉴定，发现其中有4个样品表现为阳性，说明成功获得了可用于悬浮培养的转γ-TMT基因的愈伤组织。.以黑莓品种‘Kiowa’无菌种子产生的质地疏松的嫩黄色颗粒状胚性愈伤组织为初始材料，考察了培养基种类、糖种类、蔗糖浓度、pH值、激素种类、2,4-D浓度、接种量、水解酪蛋白浓度、光照时间等因素对细胞悬浮培养效果的影响。结果表明，以MS作为基本培养液、30g/L蔗糖作为碳源、pH 6.0、附加1.0mg/L 2,4-D和200 mg/L水解酪蛋白、接种量为2g/50mL、暗处理时‘Kiowa’愈伤组织悬浮培养的效果最佳，可以获得最大生物量。并按上述条件对转γ-TMT基因的愈伤组织进行悬浮培养，对培养液中维生素E进行分离提取，并用HPLC法对其组成和含量进行测定。测得其中α-生育酚占总生育酚含量提高到85.7%