利用CRISPR/Cas9新技术筛选和鉴定端粒相关的长非编码RNA

The nucleic acid and protein interaction network is fundamental for biological processes. Our previous studies suggest that noncoding RNAs play important roles in regulating telomere length and cell senescence. Human genome contains about 110,000 lncRNAs whose functions are still less understood. These lncRNAs rely on their higher structures for specific functions. Traditional single gRNA-mediated CRISPR/Cas9 cutting hardly generates loss-of-function of lncRNAs, thus, there are few mature tools to systematically screen functional lncRNAs at present. To solve this problem, we will establish a dual-gRNA-mediated CRISPR/Cas9-lncRNAs library and try to uncover the molecular mechanisms of how lncRNAs regulate telomerase activity, telomere length and telomeric structures in stem cells by genetic screening of telomerase or Shelterin-interacting lncRNAs. Finally, we will generate lncRNAs knockout mouse models, which enable us to deeply understand the functions of specific lncRNAs in regulating telomeric stability and self-renewal of stem cells.

生命活动过程通过非常复杂的核酸和蛋白网络相互调控实现。我们前期在端粒领域的系统性工作揭示了非编码RNA在调节端粒长度与细胞衰老方面发挥重要功能。基因组中含有大量非编码RNA信息，其中长非编码RNA（lncRNAs）约有11万个，但人们对于这些lncRNAs的生物学功能还知之甚少。lncRNAs通常依赖本身形成特定的高级结构发挥功能，常规单gRNA介导的CRISPR/Cas9切割难以造成lncRNAs的功能缺失，因此目前还没有系统性筛选研究lncRNAs的成熟工具。本项目拟利用自主构建的CRISPR/Cas9-lncRNA双guide RNA打靶文库，以多能性干细胞为研究对象，筛选和检测端粒相关蛋白复合物中特异结合的lncRNAs；构建并分析特定lncRNAs的敲除小鼠模型，最终阐明干细胞中端粒相关lncRNAs的调控机制与功能网络，及其对干细胞维持多能性和自我更新能力的作用。

生命活动过程通过非常复杂的核酸和蛋白网络相互调控实现。我们前期在端粒领域的系统性工作揭示了非编码RNA在调节端粒长度与细胞衰老方面发挥重要功能。基因组中含有大量非编码RNA信息，其中长非编码RNA（lncRNAs）约有11万个，但人们对于这些lncRNAs的生物学功能还知之甚少。本项目拟利用自主构建的CRISPR/Cas9-lncRNA双guide RNA打靶文库，以多能性干细胞为研究对象，筛选和检测端粒相关蛋白复合物中特异结合的lncRNAs，在以下三方面取得了进展：1）双gRNA系统的建立与新型基因编辑工具的开发；2）非编码RNA与干细胞研究；3）端粒相关蛋白的筛选和功能研究。具体的，我们开发针对成对gRNA设计的生物信息学预测软件pgRNAFinder，并针对端粒蛋白大片段缺失敲除的成对gRNAs。通过与单条gRNA敲除效果的比较，我们发现双gRNA敲除体系具有更强的工作效力。通过筛选，我们发现Nanog互作lncRNA linc1343在干细胞干性维持及分化方面起到关键作用。为了便于示踪长非编码RNA，成功开发了一种新的实时追踪lncRNAs和进行RIP实验的lncRNAs标记系统，对于深入研究长非编码RNA提供了新工具。我们还致力于新型基因编辑工具的开发，利用二代高保真的二代碱基编辑系统（HF2-BE2）在小鼠受精卵中进行基因编辑，并开发了EndoV-seq技术以探究并提高ABE的特异性。我们系统筛选和鉴定了新的端粒相关蛋白，如SBDS和TOE1等，做了一系列深入研究，同时建立了端粒和衰老相关生物信息学分析以及基因编辑的关键平台，在端粒和衰老领域取得了一系列进展。在项目的支持下，共发表论文13篇，申请1项专利。项目成果超出预期目标。